食品发酵工程

1.1.2发酵的定义（1） 狭义“发酵”的定义＞在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。（2） 广义“发酵”的定义＞工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。1.1.3发酵工程（FermentationEngineering）的定义■发酵工程，是利用“生物细胞”的特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化和大型化）生产各种特定的有用物质，或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种生物技术体系。这里的“生物细胞”包括微生物细胞和动物、植物细胞及其固定化细胞。因此，发酵工程使渗透有工程学的微生物学，是发酵技术的工程化。■发酵工程是化学工程与生物工程技术相结合的产物，它将微生物学、生物化学、化学工程学等的基本原理和技术有机地结合在一起，利用微生物进行规模化生产，是生产加工与生物制造实现产业化的核心技术。■发酵工程技术主要包括提供高性能生产菌种的菌种技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分离纯化技术。进行发酵工程的关键技术（菌种技术、发酵技术和分离技术）及重大产品的研究开发，将发挥中国丰富的生物资源优势，提高发酵工程的技术水平，促进生物化工、生物医药、食品加工等相关行业的产品竞争力和可持续发展。发酵工程的1.4特点（1）发酵工程使用的原料来源广泛，多为农副产品，其中以碳源为主，只加入少量有机和无机氮源，不含有毒物质。（2）发酵工程的反应过程比较温和，通常在常温、常压下进行。而且，反应过程是以生物体的自身调节方式进行，多个反应就像是一个反应一样，可在单一设备中进行，因此一种设备可有多种用途。（3）容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、化学活性体等。（4）能够高度选择性地进行复制化合物在特定部位的反应，如甾体化合物的氧化、还原等。（5）生产产品的微生物菌体本身也可作为发酵产物。例如，富含蛋白质、酶、维生素的单细胞蛋白等。（6）发酵过程是纯种培养过程。生产中使用的设备、管道、截门和培养基都必须严格灭菌，通入的空气也应该是无菌空气。在操作中应特别注意严格防止污染，尤其要防止噬菌体的侵入，否则，会引起重大的损失。（7）在不增加任何设备投资的情况下，通过菌种选育，改良菌种的生产性能来提高生产能力，可以达到事半功倍的效果。（8）在发酵生产中，还可以通过改进工艺技术和设备来提高产品的产量和质量。1.6发酵工程的发展史1.6.1天然发酵阶段1.6.2微生物纯培养技术的建立1.6.3微生物液态深层发酵技术的建立1.6.4微生物酶转化及代谢调控技术的应用1.6.5微生物发酵原料的拓宽1.6.6微生物基因工程育种微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间代谢物、前提物、高分子物质以及能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核酸等＞次级代谢产物通常是在生长后期合成。＞次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，如抗生素、生物碱、色素、激素和毒素等，这些产物是对微生物本身无明显生理作用或对自身生长是非必需的，但对产生菌的生存可能有一定价值。次级代谢产物与初级代谢产物的关系＞次级代谢产物和初级代谢产物对产生菌的生长繁殖作用虽然不同，但它们的生物合成途径是相互关联的。初级代谢中产生的一些小分子化合物是所有次级代谢途径中的原料，即通过初级代谢中的糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径等所产生的物质进一步转化和合成一系列有着不同化学结构和性质的次级代谢产物。＞图2-1中简要阐明了初级代谢途径与次级代谢途径的联系与区别。2.1.1.2工业发酵常见微生物及其代谢产物1)细菌及其代谢产物放线菌及其代谢产物霉菌及其代谢产物酵母菌及其代谢产物2.1.2工业发酵对生产菌种的一般要求＞ (1)菌种不能是病源菌，不能产生任何有害的生物活性物质或毒素，以保证产品的安全性。＞ (2)有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。（3）在发酵过程中不或少产生与目标产物性质相近的副产物及其他产物，可提高营养物质的转化率，减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品的质量。（4）生长繁殖能力强，生长、反应速度快，发酵周期短，产抱菌应具有较强的产抱子能力。（5）原料来源广，价格低廉，菌种能高效地将原料转化为产品。（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并不能将前体作为一般碳源利用。（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强，以保证发酵生产和产品的稳定性。2.1.3工业发酵生产菌种来源（1） 从自然界分离筛选（2） 从菌种保藏机构获得。►（3）从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种。菌种选育就是按照生产的要求，根据微生物遗传和变异的理论，用自然或人工的方法造成菌种变异，再经过筛选而达到菌种改良的目的。菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。口自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备成单抱子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。口自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。因此，下面以从自然界中选育菌种的过程为例，阐述菌种自然选育的主要步骤。口其具体做法一般分为四个步骤：样品采集、增殖培养、纯种分离和筛选等。如果产物与食品制造有关，还要对菌种进行毒性鉴定，见图2-2。采样平板分离采样定性或半定量增殖培养I定性或半定量增殖培养I、•,、或-一-，..平板分离原种斜面增殖培养平板分离原种斜面] *初筛原种斜面.一_或....复筛,原种斜面平板分离原种斜面再复筛 初步工艺条件摸索较优菌株进一步的生产性能试验和毒性试验图2-2新菌种选育基本过程由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。常用的纯种分离方法有三种，即划线分离法、稀释分离法和组织分离法。2.2.2.2诱变育种的一般步骤利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。口诱变育种包括诱变和筛选两个部分。口诱变部分包括由出发菌株开始，制出新鲜抱子悬浮液（或细菌悬液）作诱变处理，然后以一定稀释度涂平皿，至平皿上长出单菌落等各步骤。因诱发突变是使用诱变剂促使菌种发生突变，所以诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系，亦可说这三者是诱变部分的关键所在。口筛选部分包括经单抱子分离长出单菌落后随机挑至斜面，经初筛和复筛进行生产能力测定和菌种保存（即将筛选出来的高产菌种保藏好）。口因此，可以认为，诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。最后经考察其稳定性、菌种特性、最适培养条件等后，再进一步进行中试、放大。2.2.2.瑟变育种应注意的问题口诱变成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法等。口紫外线诱变的步骤与方法：口①制备菌悬液以处于对数期的细菌斜面、抱子刚成熟的霉菌或放线菌为出发菌，进行适当的前培养，并控制前培养的最佳生理状态，一般将细菌培养16〜24h，霉菌、放线菌培养到绝大部分抱子刚刚萌发。然后，离心除去液体培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠振荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉花过滤，使形成单细胞，分散程度达90%以上。要求菌悬液浓度:细菌约为108个/mL，放线菌为107~108个/mL，霉菌为106~107个/mL口②紫外线照射处理前，先开紫外灯预热20min，使光波稳定。然后，取3mL菌悬液置于7cm培养皿中，并置于诱变箱内的磁力搅拌器上，离灯管一定距离，打开皿盖，暴露于紫外线下照射一定时间，边照射边搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。照射过程必须在备有黄光或红光的暗室内进行，以免光复活。经过紫外线诱变后的菌体转入无菌试管内，置于冰水中浸1〜2h，由于细胞参与对突变修复的各种酶类活性在低温条件下受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。口③后培养与稀释涂布照射完毕的菌悬液加入到适合的培养基中，在适宜温度下暗培养1.5〜2.0h，培养结束后，从中吸取一定量培养物按一定稀释度进行稀释，然后吸取稀释液涂皿，以未经紫外线照射过的菌悬液涂皿作为对照。培养后，挑取菌落，以待筛选。（2）亚硝基胍（NTG）诱变口亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO,颜色由黄色变为绿色，诱变效应会降低。因此，亚硝基胍须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。亚硝基胍不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。口亚硝基胍有“超诱变剂”之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。另外，亚硝基胍还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变口亚硝基胍在水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2,HNO2本身就具有诱变作用；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生CH2N2，对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化作用而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，配制NTG溶液常用适宜的缓冲液，如磷酸缓冲液和Tris缓冲液。口NTG是一种强烈的致癌物质，操作时一定要穿工作服，戴橡皮手套、口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡是接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1〜2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。NTG的诱变处理方法：口①取新鲜的斜面，用一定pH的磷酸缓冲液或Tris缓冲液洗下菌苔制备菌悬液。口②配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制时需加甲酰胺或丙酮等助溶剂少许，然后加缓溶液，其比例为9:1（缓冲溶液9mL：NTG丙酮溶液1mL），一般NTG母液配成1mg/mL，而处理浓度随菌种而异，通常细菌为100~1000pg/mL，放线菌、真菌抱子为1000〜3000|Jg/mL。口③将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置于适宜温度下保温（细菌30〜35°C，真菌25〜28C，放线菌30〜32C）处理若干时间，一般细菌处理时间为20〜60min，抱子为90〜120min。终止反应时，用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，去除药液，加无菌水使沉淀悬液并制成一定稀释度，涂布于平板。口菌种保藏的基本原理是根据微生物的生理、生化特性，人为地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的