腺病毒载体操作手册1407-R

腺病毒载体操作手册腺病毒载体操作手册1313腺病毒载体操作手册一、试验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培育基，培育1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次〔冻-融要彻底〕，2023rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。二、试验材料〔一〕腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒〔包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP〕和骨架质粒pBHGlox〔delta〕E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白〔GFP〕pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白〔RFP〕。1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：ITR

SacIIXbaI(456)

(NotI)

ITR

ITR

SacIIXbaI(456)p

(NotI)Ampr

p AgeI(731)1 U6 EcoRI(742)BamHI(748)

(NotI)

Ampr

1 (NdeI)

(AgeI(731))EcoRI(742)BamHI(748)

(NotI)(NdeI)

NsiI

NsiIpHBAd-U6-GFP5118bp

(NdeI)NheI(1384)

PCMVGFP

(NcoI)(NcoI)

pHBAd-U6-RFP4993bp

(NdeI)NheI(1384)

VRFPpUCori

PolyALoxP

[HindIIISacISalI

pUCori

LoxP

SV40PolyA

(AgeI)HindIIISacISaIIAmpr

ITR1

pMCMV

EcoRI(1042)

Ampr

ITR1

PacIpMCMV

P

PstIBamHISmaIEcoRIBglIINotINsiIpUCori

pHBAd-MCMV-IRES-EGFP5322bpLoxPSV40PolyA

IRESEGFPAgeIClaI

pHBAd-MCMV-RFP5337bpNdeINcoI

NheI

RFPAgeIClaILoxP SV40PolyA各载体用途如下表：干扰标记示踪

腺病毒载体名称pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFPpHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFPpHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP骨架质粒信息如下：2293A经培育生长增殖形成单层细胞,生长培育基为DMEM(含10%FBS)。、菌株大肠杆菌菌株DH载体质粒。293A细胞的培育〔一〕293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%集合时，一些细胞可能会丧失它们的表型。假设细胞密度持续在70%以下，QBI-293A3~4个月维持原有细胞特性。假设以293A30代内能得到最正确结果。随着传代的次数增加，293A细胞会消灭生长状态下降、突变等。为了防止活率。1、去掉上清液，参加PBS洗去残留的培育基；20.25%1~2min后，镜下观看细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，参加颖培育基吹打混匀，移入离心管中。33mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进展吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将全部细胞吸出，置于15mL50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为1010ul4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4〔得每大格细胞数10〔10倍稀释n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。5、依据细胞计数结果参加细胞冻存液〔70%完全培育基+20%FBS+10%DMSO〕,3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、其次天将细胞放于液氮罐中长期保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观看细胞状态等。〔二〕293A细胞的传代当细胞生长到集合率到达80%~90%时需要对细胞进展传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心完毕后，参加完全培育基重悬。310cm培育皿中，每个培育皿补10ml培育基。4375%CO295%相对湿度的培育箱中培育。〔三〕293A细胞的复苏时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进展复苏。137~42℃的水浴。2、查看细胞库记录，依据记录从液氮罐中取出冻存的细胞〔需戴上棉手套，防止被冻伤，快速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。315ml1ml颖的完全培育基，混匀后离心，1000rpm，5min。45ml颖的完全培育基，混匀沉淀后，转入6cm培育皿。5375%CO2和95%相对湿度的培育箱中培育。6、其次天观看细胞存活率。给细胞换一下培育基。以后每天观看细胞生长状况。四、腺病毒包装、扩增和纯化〔一〕腺病毒包装293A6cm的培育皿complex成分如下：穿梭质粒p-BHG(delta)E1,3cre

2μg4μgOptiMEM37度水浴中预热，LipofiterTM转染试剂需恢复至室温方可6h换颖培液。注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。转染前细胞必需处于良好的生长状态。病毒试验带有肯定的危急性，为了您的安全和安康，请穿试验服并戴一次性手套，在生物安全柜里进展试验操作。〔二〕病毒收集7天左右可以在显1021天内形成，空斑形成后连着琼脂糖一起将空斑挑起，放入颖培育基中过夜。〔三〕293A细胞培育液中进展病毒少量扩增。至细胞再次消灭空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收P1P1293A细胞，连续进展三代感染，至P4代进展腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进展体外纯化和浓缩。〔四〕病毒纯化病毒纯化承受CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl梯度的制备方法如下：参加2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液〔溶剂同上〕，然后缓慢参加3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液，再参加5ml的病毒悬浮液。20230rpm，室温离心2小时。收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中〔透析袋使用前用10mM的EDTA－Na煮沸10min〕〔50g2蔗糖，10ml1MTris-HCl，PH8.0，2ml1MMgCl2

搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。〔五〕病毒重悬和保存500ulPBS4需长时间存放需置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的细胞MOI不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预试验以确定目的细胞中参加的病毒数。〔一〕细胞预备241×105/ml50%70%直接。〔二〕病毒感染polybrene的选择：Polybrene:是带正电的小分子，与细胞外表的阴离子结合，提高腺病毒对细胞的感染效率，通常参加polybrene能提高感染效率2～10倍。Polybrene有肯定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反响明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene1～10μg/ml的范围筛选适宜的浓度，以24h内细胞无明显毒性反响为佳，可参考文献并进展预试验摸索，polybrene5～8μg/ml。注：1〕汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进展关心感染。Polybrene母液保存在-20℃〔1年以上〕3次以上，否则活性受影响。42周。2〕Polybrene预试验请先以比照病毒进展摸索，大局部腺病毒感染的细胞可不加Polybrene即获得很高转染效率。具体状况以预试验结果为准！感染细胞最正确MOI的测定MOI〔MultiplicityofInfection，感染复数〕是指每个细胞感染的MOI越高，腺病毒感染后宿主细胞内保存的腺病毒基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。MOI各有差异，MOIMOI。原则上每种细胞对应每种类型的病毒都应当进展最适MOI摸索试验，设置MOI梯度摸索试验，选择适合的MOI进展试验。MOI1：3：51:3:10进展梯度摸索，一般的细胞根底MOI1010，30，5010，30，100。MOI对应病毒体积的换算转染时细胞数〔一般以传代计数细胞数×2计算〕×MOI=病毒个数；则参加的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。例子：转染细胞数为105个，MOI100，则需要病毒的个数为1071010PFU/ml,107/〔1010PFU/ml〕=10-3ml=1ul。同理，300，5003ul，5ul。/MOI/1表格〔三〕I、贴壁细胞的比照病毒载体，1/2〔详见下表格〕。参加的病毒MOI=10，30，100，300，500MOI孔。对于增殖力量较弱的细胞，比方特别是一些原代细胞如神经元、心肌细胞，1/222对于增殖力量较强的细胞，如BMSC〔骨髓间充质干细胞〕，1/221/237染过夜，有利于提高感染效率。病毒小培育体积感染表培育皿外表积对应细胞培育液体积类型/cm2病毒感染对应细胞培育液体积96-well0.3cm2100ul50ul对于polybrene浓度为固定值〔5～8ug/ml〕；病毒小培育体积感染表培育皿外表积对应细胞培育液体积类型/cm2病毒感染对应细胞培育液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm20cm24ml2ml100mm60cm210ml5ml44242小时后直接换液上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，假设是悬浮或半悬浮细后〔感染体系同贴壁细胞中《病毒小培育体积感染表》〕，封好口，放入平角离心机后，低速〔900g～1500g〕离心1h，然后放入培育12小时。假设由于试验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进展低速离心，去掉大局部上清，然后参加适量的病毒液，室温放置10min〔不能超过半小时〕，然后将细胞和病2小时后换液即可。注：悬浮细胞离心感染1小时+离心后37度小体积感染1小时，一般直置换颖培液。对于少数感染效果较差的悬浮细胞，追加1/2颖培液持续感染过夜也有助于提高感染效率，但要留意不能影响细胞状态，具体步骤以试验摸索结果为准。Polybrene的使用事项同样适用于悬浮细胞。〔三〕观看感染状况24小时后，可以开头观看到GFP/RFP表达〔只对于有GFP/RFP独立表达框的腺病毒载体〕，过表达和干扰的感染时间以36-48小时试验为最正确。六、动物试验例子：小鼠尾静脉注射将纯化过的腺病毒以每只小鼠1-5×109毒滴度为1×1011PFU，则每只小鼠注射体积约为10-50ul。具体的注射量需要试验摸索，留意注射体积不要超过200ul，最好掌握在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。。附1：MOI摸索时的体积梯度规格大约数目MOI值参加病毒数量腺病毒/ul96well2-5×10450-1001-5×1060.1-0.5ul0.1；0.3；148well1-2×10550-10070.5-2ul0.5；2；624well2-3×10550-1001-3×1071-3ul1；3；1012well5×10550-10072.5-5ul2.5；7.5；256well1-2×10650-10085-20ul5；15；5035mmdish1-2×10650-10085-20ul5；15；5060mmdish2-4×10650-1001-4×10810-40ul10；30；100100mmdish6-10×10650-1003-10×10830-80ul30；100；300150mmdish1-2×10750-100950-200ul60；180；600汉恒生物腺病毒感染复数〔MOI汉恒生物腺病毒感染复数〔MOI〕与体积对应表腺病毒滴度以1010/ml为准，其他滴度需相应换算；大约细胞数目是依据80%～100%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进展细胞计数。1243×10570〔2.×105及适应的生长条件，不会到达24小时翻一倍的速度。其他规格培育可参照此cultur细胞量。是MOI客户正式试验前先进展预试验摸索最适MOI2：汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接参加直接参加直接参加换液时间2h24h24h是否需要筛选不需要，腺病毒感染力量很强的感染力量不强不强观看时间如带有GFP等荧光24h后可观36h可GFP等荧光后可以观看到表达，36hGFP等荧光观看到表达，36h到达表达顶峰，假设不带有荧光标签，则需要鉴定要鉴定要鉴定是否需要助转剂不需要据具体状况操作，据具体状况操作，由于助转剂，如polybrene，对细polybrene，对细胞的损害比较大，胞的损害比较大