微生物检验1619章螺旋体

第十六章螺旋体Spirochete中南大学湘雅医学院李登清螺旋体（spirochete)：是一种细长、柔软、螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。生物学上的地位介于细菌与原虫之间。分类学上划归广义的细菌学范畴。

形态结构

形态：为一群细长、柔软、螺旋状运动活泼的原核细胞型微生物，属细菌范畴。

结构与性状：基本结构与细菌类似，有细胞壁(含脂多糖与磷壁酸)，原始核，有核质，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感。

形态与结构

螺旋体形态结构图特点：染色着色困难—

常用暗视野，轴丝伸缩而运动

分类

依据其大小、螺旋数目、螺旋规则程度和间距分为：1目3科13个属。螺旋体目

Spirochaetales1、螺旋体科Spirochaetaceae分9个属：

疏螺旋体属（Borrelia）、密螺旋体属（Treponema）等。2、蛇形螺旋体科Serpulinaceae分2个属3、钩端螺旋体科

Leptospiraceae，分2个属：钩端螺旋体属（Leptospira）和细丝体属（Leptonema）。致病者有以下3属疏螺旋体属（Borrelia)：伯氏疏螺旋体，回归热螺旋体

致病：莱姆病、回归热钩端螺旋体属（Leptospira）：问号状钩端螺旋体；

致病：钩体病

密螺旋体属（Treponema）：梅毒螺旋体；

致病：梅毒钩端螺旋体密螺旋体疏螺旋体第一节钩端螺旋体

是引起自然疫源性急性传染病、钩端螺旋体病的病原体，主要是问号状钩端螺旋体。为人兽共患病。

（引起人类这类疾病的病原体，不是人类本身固有的，而是来源于自然界动物。由这类病原体引起人类的疾病，统称为自然疫源性疾病）

一、临床意义

问号状钩端螺旋体，具有较强的致病性（毒素、酶类），致钩端螺旋体病。引起钩体病带菌（问号状钩端螺旋体）的动物，世界上己发现200多种动物携带此菌，我国有50多种动物携带，主要是黑线姬鼠等鼠类和猪是常见的储存宿主，鸡鸭鹅兔、蛇蛙等也为储存宿主。（一）致病物质

1.内毒素样物质(ELS)

细胞壁中含类似脂多糖物质（LLS），引起的病理变化与典型的内毒素相似，只是毒性较低。2.溶血素

波摩那型、犬型、七日热型产生溶血素，破坏红细胞膜而溶血。

溶血素不耐热，56℃经30分钟失活，对氧稳定，可被胰蛋白酶破坏。

3.细胞毒性因子(CTF)注射小鼠，可出现肌肉痉挛、呼吸困难而死亡。4.细胞致病作用（CPE）物质

引起细胞退行性病变；注射家兔，可形成红斑和水肿。（二）所致疾病

钩端螺旋体病

人兽共患传染病，多宿主（鼠和猪为主），传播途径有：主要为接触传播。

♦人与污染水或土壤接触

♦黏膜或皮肤侵入

♦消化道黏膜（污染食物/饮水）

♦胎盘垂直传播

♦吸血昆虫流行特点季节性（夏秋）：洪水型—猪，

稻田型—鼠

雨水型—猪与犬地区性：

三多－鼠、猪、水职业性：

农民、矿工、饲养员

带菌动物污染环境（水、土壤）损伤的皮肤或粘膜血、淋巴系统全身毛细血管内皮损伤并伴有循环障碍钩体血症CNS、心、肺、

肾、肝功能受损中毒症状尿致病性

先形成钩体血症，损伤全身毛细血管内皮细胞及肝、肾、肺心及中枢神经等多器官损伤，出现休克、DIC、黄疸、出血、心肾功能不全、脑膜炎等。临床特点

起病急，高热、乏力、全身酸痛、结膜充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大；

三大症状：寒热、身痛、一身乏

三大体征：眼红、腿疼、淋巴大免疫性

体液免疫为主，病后获得对同型钩体的持久免疫力。附表钩体病主要流行类型及特点

稻田型雨水型洪水型

主要传染源鼠类猪与犬猪

主要菌群黄疸出血群波摩那群波摩那群

传播因素鼠尿污染暴雨积水洪水淹没

感染地区稻田、水塘地势低洼村落洪水泛滥区

发病情况较集中分散较集中

国内地区南方水稻耕作区北方和南方北方和南方

临床类型流感伤寒型流感伤寒型流感伤寒型

黄疸出血型少数脑膜炎型

肺出血型

临床表现

Clinicalfeature1、早期（败血症期，流感伤寒型）

类似感冒，起病多急骤。（1）发热：T>39℃，热程1周±。（2）全身酸痛：头、腓肠肌、腰肌为著。（3）全身软弱无力。（4）结膜充血：轻者眼结膜充血，重者膜下出血。（5）浅表淋巴结肿大等。本期持续5-10天，绝大部分病例此时钩体自血液及脑脊液中消失。结膜充血—眼红结膜网状充血

结膜下出血end2、中期（内脏损害期，病死率高）（1）肺出血型：颇为常见。

以全身毒血症状及轻重不一的咯血为特征。（2）黄疸出血型（3）脑膜脑炎型

（4）肾病功能衰竭型（5）休克、DIC等

3、后期（恢复期）：

后发热，闭塞性脑动脉炎，葡萄膜炎

预防原则：

1、防鼠、灭鼠，加强对带菌家畜的管理

2、接种多价钩体疫苗：在常年流行地区，对易感人群和与疫水接触者宜接种包含当地流行株在内的多价钩端螺旋体疫苗。防治原则预防接种

多价钩体菌苗

(钩体疫苗为全菌死疫苗)

对象

:重点流行区人群(禁忌症除外);一般流行区,主要是需接触疫水者;新入疫区者,疫区儿童、饲养员、屠宰人员。

时间:流行前l个月,多在4月底至5月初完成。

方法:每年两次皮下注射，第一次lml第2次2ml，间隔7～l0天。儿童剂量减半。浓缩菌苗剂量减半。

接种反应

:接种后l月左右产生免疫力，保持约l年。

预防治疗

对进入疫区短期工作的高危人群，可服强力霉素预防，0.2，每周l次。对高度怀疑已受钩体感染但尚无明显症状者，可每日肌注青霉素80万～l20万U，连续2～3天。治疗原则

三早一就地原则,即早期发现,早期诊断,早期治疗,就地或就近治疗。

1、一般治疗卧床休息,给予高热量、易消化食物,保持水和电解质平衡,高热酌于物理降温,加强病情观察与护理。

2、病原治疗杀灭病原菌是治疗的关键和根本措施,应早期应用有效抗生素,钩体对青霉素、庆大霉素、

四环素等敏感。

青霉素首选，注意赫氏反应。（1）青霉素

为首选药物常用剂量为40万U,6~8小时l次,肌注,疗程7天,或至热退后3天。由于可能发生赫氏反应,有人主张以小剂量开始,首剂5万U,4小时后l0万U,逐渐过渡到40万U或在应用青霉素的同时静滴氢化可的松200mg。赫氏反应是青霉素治疗后的一种加重反应,一般在首剂后半小时至4小时内发生。表现为患者突然出现寒战高热头痛全身痛心率和呼吸加快,原有症状加重;部分病人可出现体温骤降,四肢厥冷,持续30分钟至l小时;也可诱发肺弥漫性出血,导致病人死亡,应高度重视。赫氏反应是由于大量钩体被青霉素杀灭后释放毒素所致,当青霉素剂量较大时容易发生,故首剂宜小和分次给药。

赫氏反应(Herxheimerreaction)。（2）庆大霉素

青霉素过敏者可改用庆大,8万单位肌注,每8小时l次,疗程同青霉素。

3、对症治疗

对于病情较重的病人均宜常规给予镇静剂,如地西泮（安定）、苯巴比妥、异丙嗪或氯丙嗪,必要时2～4小时后重复一次。

（1）赫氏反应尽快使用镇静剂,并静滴或静注氢化可的松。

（2）肺出血型特别是肺弥漫性出血型患者应及早加强镇静剂的使用,及早给予氢化可的松缓慢静注。严重者氢化可的松每日用量可达l000～2000mg。根据病情给予强心药毛花甙丙。

（3）黄疸出血型加强护肝、解毒、止血等治疗,治疗原则与方法同病毒性肝炎的治疗。如有肾功能衰竭,按急性肾衰处理。4、后发症治疗

（1）后发热反应性脑膜炎,一般对症治疗,短期即可缓解。

（2）葡萄膜炎可用1%阿托品或l0%新福林滴眼扩瞳,必要时可服用或注射肾上腺皮质激素。

（3）闭塞性脑动脉炎大剂量青霉素联合肾上腺皮质激素治疗,辅以血管扩张药。

二、微生物学特性1、形态结构问号钩端螺旋体的螺旋细密、规则，一端或两端弯曲使菌体呈C、S型，故名。G-、但不易着色，

Fontana镀银染色法：棕褐色暗视野显微镜：运动活泼、折光性强的白色的钩端螺旋体。

问号状钩端螺旋体基本结构：

外膜，内鞭毛和原生质圆柱体。两根内鞭毛缠绕在原生质圆柱体表面呈螺旋状，使其能活泼地沿长轴旋转向前运动。该菌革兰染色阴性，不易着色。常用Fontana镀银染色法呈棕褐色。2、抗原构造属特异性抗原：糖蛋白或脂蛋白。

只存在于钩端螺旋体属中，故属特异性抗原有助于钩端螺旋体病的血清学诊断。群特异性抗原：菌体脂多糖复合物（菌体内）型特异性抗原:

菌体表面，有表面抗原，多糖蛋白复合物。显微镜凝集试验（MAT）和凝集素吸收试验（AAT）可用于血清群和血清型分型。我国有19个血清群、161个血清型。3、基因组

问号状钩端螺旋体基因组DNA己测序的有两个血清型：黄疸出血群赖型56601株和黄疸出血群哥本哈根型FiocruzL1-130株，均有大小两个环状的染色体。4、培养特性需氧、营养要求较高，常用Korthof（柯氏）（含10%兔血清）液体培基（致病性螺旋体中唯一可以人工培养的）28℃～30℃，pH7.2-7.6培养1～2周，液体培养基:半透明云雾状混浊（液面1cm的部位最丰富）固体培养基:形成扁平、透明、不规则菌落。

问号状钩端螺旋体不分解糖类和蛋白质，能产生过氧化氢酶，有的问号状钩端螺旋体株可产生溶血素。5、抵抗力较细菌弱，但比其他致病性螺旋体强。

4℃14d仍生长，耐冷不耐热，湿土中生存半年以上，水中生存数周～数月。

0.2%甲酚皂、1％苯酚、1：2000升汞经10～30min可杀灭。

60℃1min死亡。

对青霉素敏感。（一）标本采集：可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得，标本有血、尿、CSF。（二）程序

标本（血、尿、CSF等）

动物接种镜检PCR分离培养（Korthof培基）心血培养

28℃

1-2周暗镀直鉴定视银接

野染免血清学试验（MAT、ELISA等）色

疫荧光

三、微生物学检查

（三）方法

1、直接涂片镜检

直接显微镜检查：暗视野、Fontana镀银染色、直接免疫荧光。

2、分离培养

Korthof培养基

(1)血：1周内采血1-2ml培养，阳性率70%～100%连续观察30天未见菌生长，方能报（-）。

(2)尿、CSF：2周～

5周（

3）鉴定：取混浊培养物经离心沉渣用暗视野或镀银染色显微镜检查，如有问号状钩端螺旋体存在，则用已知诊断血清鉴定其血清群和血清型。

DNA杂交

用同位素、生物素、地高辛标记钩体特异DNA探针检测尿中钩体DNA。动物接种是分离钩体的一种敏感方法，尤其是有杂菌污染的标本，通过动物可获得纯株。黄疸出血型对豚鼠、金黄色地鼠最敏感

5、血清学试验

抗体检测（1）显微镜凝集试验（microscopicagglutinationtest,MAT）当待检血清中有相应抗体存在时，则钩体被凝集成团，形如蜘蛛样；若血清中抗体效价较高时，钩体可先被凝集而后溶解呈折光率高的团块或蝌蚪状。

抗原：标准菌株（或当地流行株）

4～

7天培养物（活钩体）方法：病人血清（56℃，30min灭活)

稀释成1:50、1:100、1:200等。0.1ml血清+0.1ml活菌→28℃～30℃，2h→暗视野观察。结果：以2+的最高血清稀释度为血清效价，大于1:300有意义，或恢复期比早期增高4倍可确诊本病。

抗体检测

显微镜凝集试验

钩端螺旋体凝集试验（暗视野）

阴性对照阳性反应（++）

（2）间接凝集试验将钩体属特异抗原吸附于载体颗粒上+病人血清（抗体）→凝集（载体颗粒凝集，故为间接）常用的有：间接血凝（绵羊红细胞）试验，胶乳凝集（聚苯乙烯胶乳微小颗粒）及凝集抑制试验。

单份血清标本活性炭凝集效价>1：8、胶乳凝集效价>1：2可判为阳性，双份血清标本效价呈4倍以上增高则更有诊断价值。

凝集抑制试验原理

早期病人血清（尚无抗体）

+钩体免疫血清

（血清中有抗原则结合消耗免疫血清的抗体）

+钩体抗原致敏的胶乳悬液→

不凝集，为阳性

6.动物试验（3）TR/PatocⅠ特异性属抗原玻片凝集试验

主要测IgM（属特异性抗体），适于早期诊断和流调。

（4）酶联免疫吸附试验(ELISA)被测血清OD值，为阴性对照血清的2倍，为阳性。

适用于有杂菌污染的标本。常用幼龄豚鼠或金地鼠。第二节密螺旋体属

密螺旋体的螺旋细密、规则、两端尖、数目较多，分为致病与非致病两大类。对人致病的有：苍白螺旋体：苍白亚种梅毒

性病地方亚种地方性梅毒极细亚种雅司病非性病品他螺旋体：品他病

(一)临床意义：1.致病物质：

外膜蛋白：黏附作用表面粘多糖和唾液酸：形成荚膜样物质。透明质酸酶免疫逃逸过敏反应2.所致疾病：

梅毒

先天性梅毒：母体通过胎盘传给胎儿

获得性梅毒：性传播、输血传播梅毒螺旋体

先天性梅毒（胎传梅毒）

：多发生于妊娠4个月之后。引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎。出生梅毒儿，呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等特殊体征。很难诊断，可用RPR半定量试验每月检测1次，连续6个月，检测反应素效价，或用VDRL定量试验查抗体效价变化。如效价增高或稳定在高水平，表明是先天性梅毒。如抗体是来自母体lgG，通常在2～3月内消失。

先天性梅毒（胎传梅毒）早期先天梅毒获得性梅毒Ⅰ期（初期）梅毒：感染性极强，破坏性小感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳，多见于外生殖器，一般4~8周后，常自愈。Ⅱ期梅毒：感染性强，破坏性小发生于硬下疳出现后2~8周。苍白亚种螺旋体血症，全身皮肤、粘膜常有梅毒疹，全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他脏器。Ⅲ期(晚期)梅毒：感染性小，破坏性大发生于感染2年以后，亦可长达10~15年的。病变可波及全身组织和器官。基本损害为慢性肉芽肿，局部组织坏死。损害常进展和消退交替出现。皮肤、肝、脾和骨骼常被累及。可危及生命。Ⅰ期（初期）梅毒：巨大下疳

Ⅱ期梅毒

II期梅毒：梅毒疹Ⅲ期(晚期)梅毒

晚期梅毒的溃疡、坏死

III期（晚期）梅毒8~14个致密而规则的小螺旋，两端尖直，原生质圆柱体上紧绕着3~4根周浆鞭毛，故运动活泼，运动方式多样。革兰染色阴性，不易着染Fontana镀银染色法→染成棕褐色（二）生物学性状1、形态与染色不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖，且生长慢。在家兔上皮细胞培养中能有限生长，繁殖慢。3、基因组

环状DNA，约为1138006bp，G+C平均为52.8mol％。2、培养4、抵抗力极弱对温度和干燥特别敏感。对常用化学消毒剂亦敏感，1%~2%石炭酸内数分钟就死亡。对青霉素、四环素、红霉素或砷剂均敏感。5、抗原成分表面抗原

—

刺激机体产生凝集抗体、制动抗体或溶解抗体，但梅毒、雅司、地方性梅毒和品他病等4种密螺旋体抗原性相同。膜蛋白抗原

有22种，内鞭毛蛋白有38种，其中外膜蛋白的47kD蛋白和内鞭毛的37kD蛋白有很强的免疫原性。类属抗原磷脂半抗原与宿主蛋白结合，刺激机体产生抗磷脂自身抗体即反应素，可与牛心肌类脂抗原发生反应。假阳性

—

与雅司、回归热、鼠咬热、疟疾、麻风有交叉反应

（三）微生物学检验1、标本：Ⅰ、Ⅱ期梅毒取下疳渗出液、梅毒疹渗出液或淋巴结穿刺液。先天性梅毒：脐血。2、检验程序：3、直接镜检：主要适用于初期梅毒的筛查，患者下疳分泌物中有大量螺旋体。暗视野；Fantana镀银染色或免疫荧光。菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内梅毒密螺旋体检验程序

有病损无病损（下疳、皮疹、淋巴穿刺液）（血清、血浆）

暗视野、直接荧光阴性非密螺旋体抗原检测抗体（筛选）

阳性PCR反应性无反应性

阳性滴定重复试验初报密螺旋体抗原试验（确定）反应性，阳性无反应性，假阳性非特异性：非密螺旋体抗原试验

抗原(正常牛心肌的心脂质)→血清中的反应素(抗脂质抗体)方法:VDRL和RPR试验。适用于大量初筛。特异性：密螺旋体抗原试验

抗原（Nichols株螺旋体）→螺旋体特异抗体

优点：特异性强，可用作梅毒证实试验常用方法：4、抗体检测

非特异性非密螺旋体抗原试验：

1)性病研究所实验室(VDRL)玻片试验（VenerealDiseaseResearchLaboratory）

抗原：(0．03％心拟脂、0．21％卵磷脂、0．9％胆固醇，用无水乙醇配制)

待检血清：经56℃30min灭活，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片5min充分混匀反应后观察结果。

结果：有大片絮状凝聚物为(3+)，中等凝聚物为(2+)，细小凝聚物为(+)，液体混浊为(—)。2)快速血浆反应素环状卡片试验(RPR,RapidPlasmaregioncirclecard)用活性炭颗粒吸附VDRL抗原。与反应素结合形成黑色凝集块，可肉眼观察结果。取待检血清加于环状卡圆圈内，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋转摇匀8min，观察结果。在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。特异性密螺旋体抗原试验：

由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，所以用非密螺旋体抗原血清学试验不能区别这些密螺旋体及其所致疾病。用密螺旋体抗原试验检测病人血清中特异性抗体做确证实验。

1)荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)

先用非致病性螺旋体Reiter株去除病人血清非特异性抗原，提高特异性，稀释成不同稀释度，加于预先涂有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，37℃孵育30min，洗片后再用荧光素标记的羊抗人丙球蛋白抗体，在荧光显微镜下观察。

阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-ABS试验具高度特异性和敏感性，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。2)梅毒螺旋体荧光抗体双染色试验

(FTA—ABS-DS)

用Nichol株梅毒螺旋体作抗原，加入待测血清，用四甲基异硫氰酸罗丹明结合的抗人球蛋白抗血清及异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗梅毒螺旋体球蛋白双重染色，用间接免疫荧光技术检测血清中的抗TPlgG抗体。FTA-ABS-DS法无论对早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特异性，且阳性出现时间早。一期梅毒阳性率达90％，晚期梅毒的阳性率为95％。对确诊病人的敏感性和特异性分别为91.7％和92.0％，但技术要求较高，且较费时费钱，因此多用于实验室试验。3)抗梅毒螺旋体抗体的微量血凝检测

(MHA-TP)

用抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋体(Nichols株)提取物去致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先与非致病性Reiter细胞作用。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以排除非特异性凝集。4)梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验

（TPPA）将梅毒螺旋体Nichols株的精制菌体成分包被在人工载体明胶颗粒上，产生粒子凝集反应，出现明胶颗粒凝集者为阳性。主要测血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体及抗体效价。常用于筛选试验阳性标本的确诊试验。5)ELISA用Nichols株为抗原，以超声波击碎。此法可用于各期梅毒诊断，灵敏度为96％，对感染血清灵敏度为95％。与荧光抗体双吸收法(FTA-ABS-DS)比较，两法符合率为96％。ELISA试剂具有价廉、保存时间久且稳定(4个月)等优点，是目前梅毒血清学诊断试验的首选方法。

6)免疫印迹试验

(immuno-blottingtest)

将梅毒螺旋体抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)后，再将凝胶中的抗原经电转移至硝酸纤维薄膜上，将膜切成1．5mm宽小条。试验时加病人血清20μl(1:100稀释)，置摇床上室温过夜，次日用洗涤液洗3次后，加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗血清(1：500稀释)，室温作用1小时后，加底物显色5min后用蒸馏水冲洗，终止反应。出现蓝色区带为阳性。WHO推荐用VDRL、RPR法对血清进行初筛试验；出现阳性者用FTA-ABS、FTA-ABS-DS、MHA-TP、TPPA、ELISA和免疫印迹试验等方法做确认试验。

第三节伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)伯氏疏螺旋体是莱姆病（Lyme）的病原体。1977年在美国康涅狄格州的莱姆镇发现，1982年从硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。1985年我国黑龙江省林区首次发现莱姆病，1988年从患者血中分离出病原体，全国27个省、自治区有此病存在。lyme病

回归热螺旋体

疏螺旋体属螺旋体螺旋少而稀疏，且排列不规则，呈波状，运动活泼。在自然界中存在宿主与媒介。疏螺旋体伯氏疏螺旋体流行性回归热地方性回归热

（一）临床意义1.致病物质粘附素，外膜蛋白OspA，LPS2.自然储存宿主野生或家养的哺乳动物，以啮齿动物的鼠、鹿、熊为主。我国的黑线姬鼠等。3.传播媒介硬蜱（菌在蜱中肠内生长繁殖，叮咬宿主感染）4.Lyme病临床表现

莱姆病临床表现主要传播媒介为硬蜱经3~30d潜伏期，在叮咬部位可出现一个或数个慢性移行性红斑(ECM)。晚期主要表现为慢性关节炎、慢性神经系统或皮肤异常。为自然疫源性传染病。游走性红斑莱姆病的传播媒介（二）微生物学特性

1．形态染色

疏螺旋体，两端稍尖。运动活泼，有扭转、翻滚、抖动等方式。在培养基中，不规则地缠绕一起，呈卷圈状。周浆鞭毛数2200根不等。与运动有关。Ｇ-，不易着色。Giemsa或Wright染色均好。Giemsa染色为淡紫色，镀银染色为棕褐色。伯氏疏螺旋体（电镜×2000）

2．抗原成分

主要的有鞭毛蛋白(40kＤ)、外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致病原之一。3.基因组基因组DNA约1519132bp，由线性染色体与线性及环状质粒组成。4.培养特性营养要求高，培养基需含有长链饱和与不饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和牛血清蛋白及热灭活兔血清等。微需氧，5％-10％C02促进生长。适宜温度为35℃。生长慢，1代需18h，需培养1～3周观察到生长情况。（三）微生物学检验

1．标本采集早期取病损皮肤组织、淋巴结抽出液、血液、关节滑膜液、脑脊液、尿液等。2.直接镜检用暗视野显微镜，观察关节滑膜液、脑脊液、尿液等标本中螺旋体的形态和运动。因数量太少，故在实验室诊断中价值不大。用于蜱内脏组织检查,检出率较高。3.核酸检测用PCR技术检查DNA，方法快速、敏感性高，用已知引物，以标本中螺旋体质粒DNA片段为模板，扩增后形成309bp的DNA分子(是编码OspA的基因片段)，经琼脂糖电泳证实。此DNA分子在所有伯氏疏螺旋体菌株中均可被检出，而其他菌种则为阴性。4.分离培养标本接种在BSK复合培养基中，33℃孵育。BSK培养基是含有牛血清白蛋白(BSA)和热灭活兔血清等的液体培养基，通常从感染的脾中分离螺旋体较易获得，而从损伤皮肤中分离较难。因分裂1代需12h以上，需培养2-3周可观察生长情况，长者要12周之久，定期用暗视野显微镜观察。5.抗体检测（1）间接免疫荧光法(IFA)将螺旋体在BSK中培养5-7天，离心8200rpm30min收集螺旋体，稀释至200个螺旋体／高倍镜视野。取20μl悬液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待检血清以PBS倍比稀释，于玻片加10～15μl稀释血清，湿盒内37℃孵育30min，洗后加荧光素标记抗人IgG。IFA操作简便实用，但类风湿性关节炎和其他螺旋体病可出现假阳性反应。（2）ELISA

简单快速，为常用方法。主要检测特异性IgM和IgG抗体，IgM主要靶抗原是表面抗原蛋白和鞭毛抗原。IgG主要靶抗原是外膜蛋白C和鞭毛蛋白。由于其有共同抗原和抗原的差异和变异，其结果应结合临床。（3）免疫印迹法

优于ELISA，敏感性特异性均好。有助于排除ELISA出现的假阳性结果。可直接检测该菌的蛋白成分，也可检测患者产生的抗体某种蛋白成分。6.动物试验常用的实验动物有小白鼠，金地鼠和兔等。以螺旋体悬液感染，可出现与人类相似的皮损症状，血培养亦阳性，抗体效价显著升高，可作为良好的动物模型，常用新西兰白兔。动物试验虽是一种经典的方法，但较繁琐，有生物危害，现少用。二、回归热疏螺旋体病原体：回归热疏螺旋体，我国多见。1、流行性回归热（虱传回归热）

传播途径：体虱带菌，人被虱叮咬感染。

临床症状：螺旋体反复入血，致发热1周，退热而体温正常1周，高热反复发作3～10次而称之回归热。2、地方性回归热（蜱传回归热）

病原体：杜通疏螺旋体等15种

传播途径：带菌软蜱，叮咬人感染

储存宿主：啮齿动物

临床症状：与虱传型相似1.体内正常菌群，寄生在口腔、齿龈及咽部2.常与寄居在口腔的梭形杆菌协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、溃疡性口腔炎、口颊坏疽3.对青霉素、四环素等敏感三、奋森螺旋体第十九章立克次体

立克次体(Rickettsia)是一类专性活细胞内寄生的、微小杆状或球状的G-原核细胞型微生物，是引起斑疹伤寒、恙虫病、埃立克体病等传染病的病原体。由美国医师H.T.Ricketts首次发现。一、分类：5、巴通体属（Bartonella,包括罗沙利马体）对人致病的立克次体包括五个属：1、立克次体属(Rickettsia)斑疹伤寒群斑点热群2、柯克斯体属(coxiella)3、东方体属（Orientia,包括恙虫病群）4、埃立克体属(Ehrlichia)

立克次体的共同特点是：

1.大小介于细菌与病毒之间；

2.有细胞壁，但形态多样；

3.绝大多数为专性细胞内寄生；

4.含有DNA和RNA两种核酸，以二分裂方式繁殖；

5.大多是人兽共患病原体，引起人类发热出疹性疾病；

6.以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；

7.对四环素、氯霉素等抗菌药物敏感。

H.T.Ricketts1909年，首次发现斑疹伤寒的病原体，并因研究此病而牺牲，1916年人们以他的名字命名这类病原体作为纪念。

二、临床意义脂多糖（LPS）

：引起发热、休克等一系列反应磷脂酶A：引起溶血，细胞损伤等。立克次体在血管内皮细胞中的大量增殖，引起血管内皮细胞肿胀、浸润、坏死，血栓形成等，造成微循环障碍。可引起以发热、出疹为特征的疾病。临床意义

立克次体是一种人兽共患病原体，对人类有致病性的已知为20余种。常以节肢动物为媒介或储存宿主，自然条件下在嗜血节肢动物和哺乳类动物间传播循环，人类罹患主要是嗜血节肢动物侵袭。病者排泄物尘埃或气溶胶—

呼吸道感染。我国已证明存在斑疹伤寒、恙虫病、斑点热、Q热、埃立克次体病。

变异性

立克次体经过连续传代后毒力减弱或变为无毒、抗原性无显著差异，普氏立克次体变异株自然情况下难以生长，可保持遗传稳定性，斑点热群和恙虫病立克次体株，有很大的毒力和抗原性差异

生活力与抵抗力

对一般理化因素抵抗力不强：56℃30min死亡常用消毒剂（次氯酸盐、来苏）可短时间杀灭,媒介昆虫粪便中能抗干燥、抗寒、保持传染性6个月,

Q热立克次体抵抗力最强，恙虫病立克次体最脆弱,青霉素一般无作用，磺胺类不能抑制其繁殖,治疗应用广谱抗生素

致病性立克次体及其所致疾病

普氏立克次体流行性斑疹伤寒人虱虱粪经伤口感染莫氏立克次体地方性斑疹伤寒鼠蚤蚤粪经伤口感染立氏立克次体落矶山斑点热蜱蜱叮咬贝氏立克次体Q热蜱接触、呼吸道等恙虫病立克次体恙虫病恙螨恙螨幼虫叮咬查菲埃立克体单核细胞增多蜱蜱叮咬五日热巴通体战壕热人虱虱粪经伤口感染病原体

所致疾病

媒介

传播方式致病性：1.普氏立克次体:⑴.传染源:患者（唯一传染源）⑵.传播媒介:人虱⑶.所致疾病:流行性斑疹伤寒（虱传斑疹伤寒）病人另一人人虱(抓破的伤口进入体内)流行性斑疹伤寒随粪便排出2.斑疹伤寒立克次体:⑴.传染源:患鼠、患者

⑵.传播媒介:鼠蚤、鼠虱

⑶.所致疾病:地方性斑疹伤寒（鼠型斑疹伤寒）

⑷.传播途径:蚤粪中立克次体破损皮肤体内

口、鼻

眼结膜斑疹伤寒3.恙虫病立克次体:⑴.传染源:带病原体的野鼠和家鼠;

⑵.传播媒介:恙螨;

⑶.所致疾病:恙虫病带菌鼠人体局部红色丘疹水疱,中央溃疡

形成黑色焦痂

全身淋巴结肿大，肺、肝、脾、脑等损害恙螨幼虫叮咬恙虫病皮肤焦痂4.贝纳柯克斯体（Ｑ热柯克斯体）:⑴.传染源:家畜（牛、羊等）;

⑵.传播媒介:蜱

⑶.所致疾病:Ｑ热（疑问热）⑷.传播途径:家畜污染环境人体粪便、尿直接接触呼吸道、消化道

斑点热病人全身性红斑，出血甚至肢端坏死有的立克次氏体酿成严重疾病，如人类的流行性斑疹伤寒、羌虫热、Q热等，并常伴随着灾害、战争和饥饿，曾长期与人类的痛苦、灾难联系在一起。猫抓病

大小介于细菌与病毒之间，能通过细菌过滤器；呈杆状或球状，G-

，Giemsa染色成紫红色；

同时含DNA和RNA含两种核酸，行二分裂繁殖；具有细胞壁和细胞膜，细胞壁最外层有多糖组成的粘液；层，形成微荚膜，具粘附和抗吞噬作用；

专性细胞内寄生，除五日热巴通体外均不能人工培养生长生长缓慢，常接种鸡胚（卵黄囊）培养；对四环素、强力霉素等抗生素敏感。

（一）基本特性三、微生物学检查立克次体在胞内大量生长，胞核被压向一侧。不同立克次体的细胞内位置：普氏立克次体：细胞质分散存在；恙虫病东方体：细胞质近核处成堆存在；斑点热立克次体：细胞质内和核内生长；Q热柯克斯体：细胞质空泡（吞噬溶酶体）内生长；五日热巴通体：粘附于细胞外表面生长。细胞中的立克次体人粒细胞埃立克次体Q热立克次体在小鼠脾细胞空泡内立克次体在田鼠阴道上皮细胞内生长。（二）检验程序

1.标本采集

发热期常用患者血液分离标本

初期易于检出，需作双份血清试验活检或尸检材料

（1）病人血液

病程第一周内，使用抗生素前采血接种动物或培养病程一周后采血，应分离血清

血清—

血清学试验

血凝块

—

接种培养，避免抗体和抗生素的影响

（2）活（尸）检材料

①组织标本作印片直接检查；

②制成10%～20%悬液，离心取上清接种

2、标本直接检出

（1）免疫荧光检测

组织印片荧光检查或常规染色镜检或组织病理切片检查组织标本为肺、脾、心瓣膜赘生物及肝、肾、皮疹活检

(2)PCR

用立克次体编码属特异性基因序列设计引物，用PCR直接快速诊断并分型

3、分离与鉴定（1）立克次体分离

1）动物接种

豚鼠或小鼠

豚鼠用雄性，观察阴囊反应

小鼠用于分离恙虫病立克次体、小蛛立克次体和腺热埃立克体

（2）鉴定

1）免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的Ag2）已知抗原测恢复期动物血清的Ab3）先鉴定群，进一步作种的鉴定4）罗沙利马体—荧光抗体、生化反应、细胞脂肪酸和16srDNA序列等作判断

2）人工培养基培养

罗沙利马体感染病人的血液或病变组织接种于脑心浸液双相琼脂或血琼脂，生长慢，原始菌落呈菜花状

触酶、尿素酶等生化反应均为阴性

3）细胞培养

▲腺热埃立克体可在：人单核细胞、血管内皮细胞、鼠巨噬细胞P38801生长

▲查菲埃立克体用犬巨噬细胞系DH82培养