盐源山蛭抗凝血多肽的分离与纯化

盐源山蛭抗凝血多肽的分离与纯化

血郁病的心脑血管疾病已成为人类健康和生存的大敌。世界各国都在大力推广人和物质，促进、控制和研究抗凝剂。水硫是天然抗凝剂的重要来源之一。盐源山府是一种陆生蚱。不同来源的抗凝剂可以通过不同的方法分离和提取，离子交换层析和分子筛选凝胶过滤是分离生物因素的有效方法。在这项工作中，我们使用dea-c52（阴离子交换纤维）离子交换法和清热条件海蓬（葡萄糖）的凝胶过滤方法来提取盐源山府的抗凝剂。1材料和方法1.1凝血酶mema将盐源山蛭断头,并将头部和尾部分别立即置于液氮(-196℃)中冷冻处理后,贮于-70℃备用;DEAE-C52购自美国Whatman公司;SephadexG50、凝血酶、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠)购自美国Sigma公司;凝血酶的发色底物S-2238购自瑞典CHROMO-GENIX公司;牛血清白蛋白购自中国医学科学院血液研究所.1.2研磨法epes取100只盐源山蛭的头部,置于5mLHEPES缓冲液(10mmol·L-1CaCl2,20mmol·L-1HEPES,pH7.8),于4℃研磨匀浆,后经超声粉碎6min,匀浆液经8500g离心25min(4℃),收集上清液;将沉淀再次用HEPES缓冲液溶解后,8500g离心25min(4℃),将2次高速离心所获上清液合并,经105g超速离心60min(4℃)后弃沉淀,上清液即为粗提纯的抗凝血蛋白溶液,-20℃保存备用.1.3deea-c32的制备将2gDEAE-C52反复悬浮于大体积的双蒸水中,让其自然沉降,用倾倒法除去其中的细小颗粒;用20mL0.5mol·L-1NaOH-NaCl溶液浸泡30min,后用双蒸水洗至中性,再用20mL0.5mol·L-1HCl浸泡30min,用双蒸水洗至中性;将洗涤后的DEAE-C52悬浮于一定量的初始缓冲液(10mmol·L-1的HEPES,并用稀HCl调节pH至7.8).先在柱内加入约1/3柱高的HEPES缓冲液,后连续加入DEAE-C52悬浮液,利用重力沉降法装柱,最终柱体积约为4mL.将层析柱与蛋白紫外监测仪相连(λ=280nm),用大量HEPES缓冲液洗涤层析柱,调整蛋白紫外检测记录仪的灵敏度为0.2A,量程500mV,纸速6cm·h-1.将5mL粗提纯的抗凝血蛋白溶液于沸水浴中加热10min后,通过一个0.45μm滤器过滤,然后加入DEAE-C52柱内,用HEPES缓冲液冲洗未结合到柱上的蛋白,直至D流出液=DHEPES.即记录仪记录线回到基线;以HEPES缓冲液配制的0～2mol·L-1的NaCl进行梯度洗脱,洗脱液共50mL,以2mL·管-1收集洗脱峰.1.4抗凝血肽的制备将1.5gSephadexG50浸泡在50mL双蒸水中过夜,充分溶胀,并用倾倒法除去其中的细颗粒,后将SephadexG50悬浮于HEPES缓冲液中.在层析柱内先加入约1/3柱高的HEPES缓冲液,关闭出口,在搅拌下缓慢加入凝胶悬浮液,待自然沉降约1～2cm后,打开出口,继续加入凝胶悬浮液直至所需高度为止,并在胶面上加一个纱垫以保护胶面,最终柱体积约为18mL.将凝胶过滤层析柱与蛋白紫外监测仪相连(λ=280nm),调整蛋白紫外检测记录仪为灵敏度0.2A,量程200mV,纸速20cm·h-1.将由DEAE-C52离子交换层析分离获得的抗凝血肽样品经冷冻干燥后溶于500～1000μLHEPES缓冲液,取300μL上样,待样品进入凝胶床后,缓慢加入HEPES缓冲液,洗脱并收集洗脱峰.1.5凝血酶抑制剂用量的确定抗凝血肽抑制凝血酶的活性参照文献的方法测定并做了适当改进.在酶标盘各孔中顺序加入10μL凝血酶(10U·mL-1),10μL待测样品,150μL测活缓冲液(0.1mol·L-1Tris,0.2mol·L-1NaCl,w=2%PEG-8000,w=2%BSA,pH8.2);以双蒸水为空白,以凝血酶+HEPES为对照,37℃保温15min;在各孔中加入凝血酶底物4mmol·L-1S-223810μL,37℃保温15min后,用HAc5μL终止反应;在酶标分光光度计λ=405nm测定光吸收.根据酶活性抑制曲线计算各样品的抑制凝血酶活性.1.6抗凝血肽质量浓度的测定配制牛血清白蛋白标准溶液,质量浓度分别为:0.25,0.50,0.75,1.00,1.25mg·mL-1.用2mL石英比色皿在紫外分光光度计下测定各标准蛋白质溶液的D280,以蛋白质质量浓度为横坐标,D280为纵坐标,绘制蛋白质质量浓度的标准曲线.将各步纯化的抗凝血肽作适当稀释后,测定其D280,根据蛋白质质量浓度的标准曲线,计算各步纯化抗凝血肽的质量浓度.1.7抗凝剂的比活性根据各步纯化的抗凝血肽的活性和质量浓度,计算各步纯化的抗凝血肽的比活性.2结果与讨论2.1洗脱时cnacl盐源山蛭DEAE-C52离子交换层析洗脱曲线见图1.由图可见,洗脱曲线出现2个洗脱峰,第1个峰位于收集的第4～6管,洗脱时c(NaCl)为0.4～0.6mol·L-1;第2个峰位于收集的第13～16管,洗脱时c(NaCl)为1.3～1.6mol·L-1.这说明抗凝血蛋白粗提纯液经DEAE-C52离子交换层析后被分成了两大组分,这2个组分是在洗脱液中NaCl浓度不同的情况下被洗脱的,这是由于粗提纯液中蛋白质组分的生化特性的差异而导致与DEAE-C52的吸附能力不同所造成的.2.2抗凝血蛋白的测定抗凝血蛋白粗提取物经DEAE-C52离子交换层析后各管收集物的抗凝血酶活性的测定结果见表1.其中第13～16管洗脱收集物的A405显著低于对照缓冲液的,说明凝血酶的活性被显著抑制,即抗凝血蛋白存在于第2个洗脱峰中,由于第4～7管收集物的A405与对照缓冲液的基本相同,不具有抑制凝血酶的活性,因而不含有抗凝血蛋白.2.3抗凝血蛋白的洗脱曲线由DEAE-C52离子交换层析所获得的含有抗凝血蛋白的洗脱液经SephadexG50凝胶过滤的洗脱曲线见图2.由图可见,洗脱曲线出现2个洗脱峰,说明抗凝血蛋白粗提液经DEAE-C52离子交换层析后所获得的具有抗凝血酶活性的组分中含有分子大小不同的2类蛋白质,分子较大的一类蛋白质被先洗脱下来,即第1个洗脱峰,分子较小的一类蛋白质则被后洗脱下来,即第2个洗脱峰.2.4凝血蛋白测定经SephadexG50凝胶过滤所获得的各部分收集物的抗凝血酶活性的测定结果见表2.其中第5～7管收集物的A405显著低于对照的,说明凝血酶活性被显著抑制,即抗凝血蛋白的存在,第2～4管收集物的A405与对照缓冲液的基本一致,不具有抑制凝血酶的活性,因而不含有抗凝血蛋白.2.5抗凝血蛋白的分离纯化抗凝血蛋白纯化过程中各步骤产物的蛋白的质量浓度ρ蛋白、抗凝血酶活性a和抗凝血酶的比活性am的测定结果见表3.由表3看出,随着纯化步骤的深入,所获得的具有抗凝血酶活性的产物的ρ蛋白明显降低,粗提取物的ρ蛋白是DEAD-C52离子交换层析产物的7.62倍,是SephadexG50凝胶过滤产物的24.63倍,而抗凝血酶的am却明显上升,SephadexG50凝胶过滤产物的抗凝血酶am是DEAE-C52离子交换层析产物的4.26倍,是粗提取液的29.10倍.说明抗凝血蛋白粗提取物经过DEAE-C52离子交换层