生物医药活性肽研究进展

生物医药活性肽研究进展

近年来，生物活性物质的开发非常活跃，现在有许多产品。来自海洋生物的活性肽尽管研发历史较短,但因其具有的独特生理功能而异军突起,成为活性肽领域的研究热点。现就有关海洋生物活性肽的最新研究进展作一简要综述。1生物营养等生物代谢产物来自海洋生物的活性肽有两大类,一类是自然存在于海洋生物中的活性肽,主要包括肽类抗生素、激素等生物体的次级代谢产物,骨骼、肌肉、免疫系统、消化系统、中枢神经系统中存在的活性肽等。另一类是海洋生物蛋白质酶解产生的活性肽。由于天然存在的活性肽含量较少,提取也较困难,因此,从海洋蛋白酶解产物中寻找生物活性肽就成为人们关注的重点。1.1海帐多肽和岩鱼多糖目前,该类活性肽中研究较多的有鱼精蛋白、海绵多肽、海鞘多肽、海葵多肽、芋螺多肽、海藻多肽及鱼类多肽等。鱼精蛋白是存在于许多鱼类成熟精细胞中的一种碱性蛋白,相对分子质量较小,约为4000~10000,精氨酸占其氨基酸组成的2/3以上。海绵多肽是存在于离海绵目、外射海绵目、石海绵目、软海绵目以及硬海绵目等海绵中的环肽化合物,目前已分离得到近百种。其中有些海绵多肽的结构已经清楚,如TheonellamidesIa-Ie是一种环十三肽,富含丙氨酸和一个封闭的N末端;PhakelistatinI是由(Pro-D-Thr-Phe-Ile-Phe-Ser)组成的环肽;FenestinsA是由(L-Pro-L-Pro-L-Leu-L-Ile)组成的环肽。海鞘多肽是存在于海鞘中的环肽,自1980年从海鞘Lissoclinumpatella中发现环肽Ulithiacyclamide以来,又从加利福尼亚海域及加勒比海群体海鞘Trididenumsp.中分离出3种环肽DideminA~C,从Lissoclinum属海鞘中分离出环肽Lissodinamide4~8,从Lissoclinumbistratum属海鞘中分离得到环肽BistratamideA,B。从海葵中分离得到了3类活性肽:(1)存在于16种海葵中的鞘磷脂抑制性碱性多肽,平均相对分子质量在15000~21000之间;(2)从Metridiumsenile属海葵中分离得到的具有胆固醇抑制活性肽,平均相对分子质量在80000左右;(3)从Aiptasupallida属海葵中分离提取的多肽AiptasiolisinA。芋螺多肽是存在于芋螺中的有毒物质,也即芋螺毒素。目前已发现的芋螺毒素有近百种,大多为由10~30个氨基酸残基组成的小肽,富含2对或3对二硫键,是迄今发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽,也是二硫键密度最高的小肽。主要有α-芋螺毒素、μ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素及δ-芋螺毒素等。海藻多肽已从绿藻、蓝藻等中分离得到。据报道,绿藻水提物一种制剂,内含活性多肽成分。从培养的蓝藻中也分离出一种生理活性肽。另外,还从海藻Pyymnesiumpatelliferum属中提取出一种毒素肽Hormothamin,从蓝-绿海藻属Lyngbyamajuscula中分离得到具有细胞毒活性的环肽MajusculamideC。其他多肽还包括从铜吻蓝鳃太阳鱼中分离得到的4种具有缓激肽活性的肽类,从大西洋鳕鱼、虹鳟、欧洲鳗鱼等鱼类的嗜铬细胞组织中提取到的一系列活性肽;从海星所分泌的体液中分离纯化得到一种自主刺激因子;从印度海兔中分离得到10种细胞毒性环肽Dollabelatin1~18;从海洋贝类的神经元中提取到2种神经肽Pd5和Pd6。1.2海洋蛋白活性肽来源于陆地蛋白酶解产物的活性肽已有多种,如乳蛋白活性肽、乳酪蛋白抗高血压活性肽、大豆多肽、玉米醇溶蛋白肽、抗菌肽等。但是,来源于海洋蛋白酶解产物的活性肽还很少,目前已分离得到的海洋蛋白活性肽主要有从沙丁鱼中分离得到的8、11肽,从金枪鱼中分离得到的8肽,从南极磷虾中分离得到的3肽,从鲭鱼中分离得到的鲭鱼多肽,从东方狐鲣鱼蛋白中分离得到的多肽,从虹鳟鱼皮中得到的核蛋白肽,从鳕鱼排中分离得到的相对分子质量分别为30,10,5K和3K的4种活性寡聚肽等。本实验室近年来也已分别从罗非鱼鱼皮、牡蛎和海参的酶解物中先后分离纯化出几种具有抗ACE,抗氧化等活性的肽。2活性成分的检测不论是天然存在于海洋生物中的活性肽,还是经过酶解海洋蛋白质得到的活性肽,都具有不同的生理活性,诸如易消化吸收(比氨基酸更易吸收)、保护胃黏膜及抗溃疡作用、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、抑制肿瘤细胞生长、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等。2.1环肽的体外药养和活性肽多种活性肽具有抗肿瘤活性。从Jaspis属海绵中分离出来的环肽Japamide具有杀伤线虫活性(LD50<1μg·mL--1)和细胞毒活性,对喉上皮组织癌细胞的IC50为0.32μg·mL-1。用500μg·mL-1从Discodermilakilensis属海绵中分离得到的环肽DiscoderminsA与1μg·mL-1大田酸合用,可使荷瘤小鼠的肿瘤数从4.7降至1.1,具有显著的抑瘤作用。从加勒比海绵Discodermiasp.中分离得到的环肽PolydiscamideA对培养的人肺癌A549细胞具有细胞毒活性,其IC50为0.7μg·mL-1。从加利福尼亚海域及加勒比海群体海鞘Trididenumsp.中分离出的3种环肽DideminA-C,均具有体内和体外抗病毒和抗肿瘤活性,其中DideminB的活性最强,对白血病细胞L1210的IC50为7.5×10-4μg·mL-1。在0.1μg·mL-1时,对乳腺癌、卵巢癌具有明显的抑制活性。从Lissoclinumbistratum属海鞘中分离得到的环肽BistratamidesA和B,对人体MRC5CV1成纤细胞和T24膀胱癌细胞的细胞毒性IC50在50~100μg·mL-1之间。Pettit等从印度洋的耳状截尾海兔(Dolabellaauricularia)中先后分离到18种微量的抗肿瘤活性成分,均为多肽类,命名为海兔毒素(dolastatin)1~18。Dolastatin类化合物能抑制微管聚合,促进其解聚,干扰肿瘤细胞的有丝分裂,并对多种癌细胞有诱导凋亡作用,是一种新型的细胞生长抑制剂。其中的Dolastatin10、15正在美国进行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验,对卵巢癌和乳头状腺癌细胞有很强的抑制作用,其IC50分别为2.3×10-10和2.1×10-9mol·L-1。海参(Holothurian)属无脊椎动物棘皮动物门(Echinodermata)。新近研究表明,海参体壁中含有多种活性多肽。如从海参上皮组织中分离获得的由亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸构成的五肽(其中个别氨基酸为D-构型),相对分子质量568.1,具有抗肿瘤和抗炎活性。李鹏等从牡蛎匀浆液中分离到具有抗肿瘤作用的低分子活性肽。实验表明,此肽可以明显抑制胃腺癌和肺腺癌细胞的生长和分裂增殖,使癌细胞形态发生改变,失去原有的恶性表型,细胞周期检测出现凋亡峰。洪鹏志等研究发现,翡翠贻贝肉蛋白酶水解物在实验剂量为320mg·kg-1体重时,对昆明小鼠移植性肿瘤S-180的抑制率达到50.6%,并且还具有增强免疫功能的活性。2.2鱼类的抗菌肽水生动物抗菌肽的研究主要集中于甲壳纲动物,Saito等从鲎(Lumiluspolyphemus)体中分离得到一个79肽,与兔和牛的嗜中性白血球防御素相似;Noga等认为美洲蓝蟹(Callinectes)的血细胞具有抗菌活性;Chisholm等研究包括龙虾和对虾在内的8种甲壳动物的血细胞溶泡上清液对数种细菌的杀菌作用,证明其含有能杀灭细菌的因子;Schnapp等从青园蟹(Carcinusmaenas)的血细胞中分离得到3种具有杀菌作用的肽,它们能够选择性地作用于细菌外层细胞膜的某些组分,如带阴离子的磷脂,增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长;Song等发现罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)受感染后会诱导产生类似杀菌肽类的物质;Destoumieux等从养殖的南美白对虾(Penaeusvanname)的血细胞和血浆中分离出几种抗菌活性因子,其中3种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰阳性菌的活性。最近的研究发现,鱼类中也存在大量的抗菌肽。Oren等从豹鳎(Paradachirusmarmoratus)中分离得到一种33肽的抗菌肽,具有比蜂毒素更强的抗菌活性,其作用可与其他天然的抗菌肽如蛙皮素、杀菌肽等相比;电镜观察显示其抑菌机理是溶解细菌的细胞壁。Conlon等从海七鳃鳗(Petromyxonmarinus)的皮肤上分离得到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽,其氨基酸序列与老鼠的抗菌肽corticostatinR4和兔的抗菌肽corticostatinR1结构相似。Azumi等从一种海鞘Halocyamineroretzi的血细胞中分离得到的抗菌肽HalocyamineA不仅在体外可抑制某些鱼RNA病毒的生长,也能抑制某些海水细菌的生长;Park等从泥鳅中分离到一个21肽misgurin,具有较强的体外广谱抗菌活性,且没有明显的溶血作用,其抗菌活性是蛙皮素的2~6倍。Park等发现鲶(Parasilurusasotus)受伤后上皮黏膜细胞层分泌一种相对分子质量为2000.4的抗菌肽parasinI,具有广谱抗菌性,其抗菌活性是蛙皮素2的12~100倍。Fernandes等从虹鳟鱼皮中分离得到一种具有抗菌作用的核蛋白肽,在抵御胞内或胞外病毒方面起着关键作用。该肽的抗菌作用如表1所示。研究表明,DiscodermiakilensisDiscodermin海绵中存在的环肽DisoderminA具有抑菌活性,在浓度为3,1.6μg·mL-1时可分别抑制枯草杆菌和奇异型杆菌(IC50在3.5×10-7~7.0×10-7mol·L-1之间);加勒比海绵Discodermiasp.中分离得到的环肽PolydiscamideA也具有显著的抑菌活性,它对枯草杆菌的MIC为3μg·mL。从软体动物贝类Mytilusedulis的血液中提取到2种富含阳离子与胱氨酸的抗菌小肽,其中1种含有34个氨基酸残基,命名为Mytilin,结构如下:Gly-Cys-Ala-Ser-Arg-Cys-Lys-Ala-Lys-Cys-Ala-Gly-Arg-Arg-Cys-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Cys-Phe-Arg-Cys;另一种含35~43个氨基酸残基,属于昆虫防御家族肽,与上述的Mytilin的结构相似,这种富含8个胱氨酸的新肽具有广谱抗细菌、抗真菌活性。2.3药物的降压效果采用酶工程技术,研究人员已从多种海洋生物中分离出具有抗高血压作用的活性肽。在沙丁鱼、金枪鱼、鲣鱼、小虾、螃蟹、海藻的酶解物中均发现了具有新的氨基酸序列的降压肽。Fujita等利用嗜热菌蛋白酶消化鲣节得到8种具有不同血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的肽类,其中LKPNM(IC50=2.4μmol·L-1)可通过ACE水解得到ACE抑制活性提高8倍的产物LKP(IC50=0.32μmol·L-1)。通过给SHR小兔口服LKPNM,LKP及卡托普利(captopril),发现LKPNM和captopril在口服4h后具有最强的降压效果,且效果可持续到口服之后6h。但是,在急性对照实验中,LKP在口服2h后即可表现出最大的降压效果。LKPNM,LKP及captopril的最小显效剂量分别为8,2.25,1.25mg·kg-1。另外,虽然在体外实验中,LKPNM和KP的ACE抑制活性仅相当于卡托普利(IC50=0.022μmol·L-1)的0.92%和7.73%,但是在体内实验中,它们表现出相当高的ACE抑制活性。You-JinJeon等研究了鳕鱼排酶解得到的多肽的ACE抑制活性。发现ACE抑制活性随其相对分子质量降低而显著增加,相对分子质量为3K的多肽具有最强的ACE抑制活性,其IC50值达0.08mg·mL-1。Hee-GukByun等以阿拉斯加狭鳕鱼皮胶原蛋白为原料,采用三步循环膜反应器,分离得到相对分子质量为0.9~1.9K的肽,具有ACE抑制活性。他们进一步采用凝胶过滤、离子交换色谱及反相高效液相色谱法得到2种肽,分别由Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met构成,其IC50值分别为2.6,17.13mg·mL-1。作者采用定向复合酶解技术,从鳕鱼皮、罗非鱼皮等的胶原蛋白中分离得到相对分子质量为1K左右的具有ACE抑制活性的寡肽,并得出序列中含有疏水性氨基酸的肽有较高活性的结论。此外,从大豆、牛奶等食物中得到的许多ACE抑制肽基本上由疏水氨基酸和芳香氨基酸残基组成,溶解性较差,苦味很强,很难应用。但是,从鳕鱼排酶解物中得到的ACE抑制肽具有很好的水溶性,且无苦味,因此,更易投入实际应用。对于牡蛎水解液中的ACE抑制肽也有很多研究。Bordenave等将太平洋牡蛎(Crassostreagigas)用胃蛋白酶水解,检测水解物抑制ACE的能力,该水解物对ACE活力的IC50是72mg·L-1,水解物经反相高压液相色谱分离收集到7种组分,其中组分6的IC50是5.3mg·L-1。于娅采用酶水解法制备了对ACE具有较好抑制作用的短肽,质量浓度为0.4mg·mL-1的牡蛎功能短肽的ACE抑制率为51.4%。2.4静脉血样的ldl活性测定和生物活性Iwamoto等研究了鲭鱼肽对低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用。结果表明,鲭鱼肽能够显著延长氧化反应的诱导期(由对照组的34.1min延长到实验组的59min)。另外,他们还对16名平均年龄为19岁的女性志愿者进行了体内抗氧化实验。这些志愿者在对照期内食用含酪蛋白的食物,在实验期内食用含鲭鱼肽的食物,剂量按16.9g蛋白/d,共10d。其他膳食的组成