一种快速检测赭曲霉毒素a胶体金试纸条的研制

一种快速检测赭曲霉毒素a胶体金试纸条的研制

褐球毒素是恶菌和绿霉属产生的二次代谢产物。它包含7种结构类似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(OchratoxinA,简称OTA)的毒性最强(大鼠经口LD50为20mg/kg),WHO规定人的每天最大摄入量为16ngOTA/kg体重。OTA易蓄积于组织中,其作用的主要靶器官是肾脏、肝脏,属烈性的肾脏毒和肝脏毒,实验表明动物摄入被这种毒素污染的饲料后,就会发生急性或慢性中毒症,此外,据文献报,导OTA还具有致癌、致畸和致突变性[2~4]。OTA的产毒菌株广泛地存在于自然中,因此它极可能通过食物链进入人体,从而对人体健康构成潜在威胁。在目前条件下,要完全避免OTA对食品及饲料的污染非常困难。除了在粮食收获、储存、加工各个环节科学作业、注意防霉去毒外,唯一有效的办法是加强对食品及饲料等的监控检测,及时发现污染的食品和饲料,并立即剔除,防止OTA超标污染的食品进入人类的食物链。自VANderMerve等1965年首次报道了OTA污染的各种饲料对雏鸭、大白鼠和小白鼠的毒性作用以来,世界各国有关学者对OTA进行了许多的研究。人们相继采用了薄层层析法(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,简称ELISA)和胶体金免疫层析等方法对其进行检测和分析。TLC是OTA早期研究中最常见的检测方法,因其操作简便曾被广泛应用。但这种方法较费时(48h左右),灵敏度和特异性较差,在OTA的提取过程中所需的有机溶剂品种多且量大。HPLC法具有更高的灵敏度,可以精确地对样品中的OTA进行定性和定量分析,世界各地已有不少文献报道用高压液相色谱法检测真菌毒素,但此法不适合于大批量样品的检测。ELISA法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备,且对样品纯度要求不高,特别适用于大批量样品的检测,但由于需要多种仪器设备,不适合于现场快速抽检。胶体金免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种免疫分析方法。它是在单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项以膜为固相载体的快速检测技术。现在,国内外销售的金标免疫快速检测的成品多达几十种,如在临床检验中的过敏症标志物、心脏病标志物、药物滥用、激素检测、传染性疾病的标记物、免疫性疾病、肿瘤标记物、毒物检测、性传播疾病和其他生化指标的检测(血红蛋白、血脂等)。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备、结果判断直观可靠、经济实用的特点,容易被基层掌握并大面积推广,适应我国当前社会经济技术水平,可以在食品安全领域发挥积极作用。本研究采用胶体金免疫层析法快速检测赭曲霉毒素A,取得了较为满意的结果。1材料和方法1.1材料和设备1.1.1化学试剂及试剂赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B、桔霉素标品、氮羟基琥珀酸(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)、氯金酸(HAuCl4·3H2O)美国Sigma公司;柠檬酸三钠、碳酸钾上海化学试剂公司;NaN3湖州振兴助剂厂;NC膜、吸水纸、样品垫、胶金垫德国S&S公司。1.1.2紫外分光光度计XYZ3000平台系统、试纸条切刀美国Biodot公司;Ultrospec4300紫外可见光分光光度计瑞典Pharmacia公司;H-600透射电镜日本HITACHI公司;MA磁力搅拌加热器德国Electromantle公司;飞鸽高速冷冻离心机上海安亭科学仪器总厂。1.2方法1.2.1ota-bsa的偶联反应本实验采用氮羟基琥珀酸法(NHS)制备OTA-BSA的偶联物,其反应分为两步,第一步是OTA的活化,第二步是OTA与BSA的偶联反应。1.2.1.不同活化时间的ota、nhs、dcc的比例1mgOTA溶解于0.1ml无水THF,按OTA:NHS:DCC为1:2:4的比例,分别量取OTA、NHS、DCC,于室温下、避光剧烈摇动,活化时间为60min。活化后离心15min(4000r/min),取上清,弃沉淀;挥发THF,残留物溶于0.2ml二甲基甲酰胺。1.2.1.hahsco3中bsa的量将上述溶液滴加于5%的载体蛋白质(BSA)溶液中(BSA溶于0.13mol/LNaHCO3中),BSA的量按OTA:BSA为20:1的比例量取。室温、避光缓慢摇动,其偶联时间为90min。反应产物于0.05mol/L的NaHCO3透析72h,去除游离的OTA以及其它小分子,透析结束后样品冷冻干燥即得OTA与BSA的偶联物。1.2.2sp2/o小鼠骨髓细胞融合培养将合成好的OTA-BSA偶联物免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾脏与SP2/O小鼠骨髓细胞融合,融合细胞在选择性培养液中培养7~14d,采用间接竞争ELISA方法筛选分泌抗体的杂交细胞株,杂交细胞株进行三次克隆化,产生的克隆细胞株注入小鼠腹腔产生腹水。1.2.3醋酸钠东南角液溶胶液ph1.2.3.11.5ml腹水中加入3ml0.06mol/L醋酸钠buffer(pH=4.7),静置15min。1.2.3.216000r/min,4℃离心30min。1.2.3.3.3.制备中等层或优定剂，ph调节至4.8，加入景山最终浓度为3.3%。室温搅拌20分钟1.2.3.416000r/min,4℃离心30min。1.2.3.将上述体积添加到1.10，并添加0.1mol和epbs1.2.3.6.将ph值调节到7.4，加入饱和硫酸铵0.232g/ml1.2.3.814000r/min,4℃离心15min。1.2.3.9沉淀为0.01mol/ml1.2.3.10sephonexg25盐处理1.2.4cl4溶液的冷却在一个1L的园底烧瓶中加入500ml0.01%HAuCl4溶液,加热煮沸后立即加入1%柠檬酸三钠溶液,溶液的颜色由浅黄→兰色→深兰→红色,当溶液的颜色完全变为透明的红色时,继续回流10min后停止加热,冷却至室温。1.2.5橡胶黄金分析采用紫外可见光分光光度计和电镜检测胶体金。1.2.6单克隆抗体的制备调节胶体金溶液pH值至8.2,用恒速搅拌器均匀搅拌,同时逐滴加入抗OTA的单克隆抗体,5min内全部加完,继续搅拌30min。取1/10体积的10%BSA溶液,连续加入胶体金溶液中,全部加完后,继续搅拌15min。4℃,6000r/min离心40min。小心吸去上清,加入重悬液。1.2.7试纸条的制备用XYZ3000平台系统在NC膜上喷检测抗原(OTA-OV),在胶金垫上喷金标抗体,将样品垫、胶金垫、NC膜和吸水纸依次组装,用试纸条切刀切割成试纸条。1.2.8响应面试验试纸条平放,将样品加到试纸条的样本垫上,10min看结果。如果检测线上出现红色条带,说明样品呈阴性,如果检测线上没出现红色条带,说明样品呈阳性。1.2.9评估实验1.2.9.终浓度l用乙醇稀释OTA标准品至1mg/ml,再用纯水稀释,使其终浓度为:5、10、15、20、30、40、50ng/ml。用试纸条检测的标准方法检测,每个浓度重复5次,根据实验结果判断试纸条的检测灵敏度。1.2.9.水稀释的终浓度用乙醇稀释OTA标准品至1mg/ml,再用纯水稀释,使其终浓度为:10、100、1000、10000、100000ng/ml。用试纸条检测的标准方法检测,每个浓度重复5次,判断试纸条的检测范围。1.2.9.标准品终浓度的测定用乙醇稀释赭曲霉毒素A的结构类似物赭曲霉毒素B、桔霉素标准品至1mg/ml,再用纯水稀释,使其终浓度为:1、5、10、50、100、500ng/ml。用试纸条检测的标准方法检测,每个浓度重复5次,判断试纸条的检测特异性。2结果与分析2.1吸收曲线和峰峰测定以双蒸水作对照,用紫外可见光分光光度计在400~600nm进行扫描,测定吸收曲线和吸收峰。胶体金结果为:λmax=519nm;OD519nm=0.976,见图1。2.2磁体金透射电镜扫描结果透射电镜结果显示所制备的胶体金粒径均匀,随机测量100个颗粒,胶体金粒径在16±0.5nm,见图2。2.3ph值经pH试纸测定胶体金pH值为5.5。2.4快速检测试纸条的检测限灵敏度及检测范围实验的结果如表1所示。从表1结果中判定赭曲霉毒素A快速检测试纸条的检测限为10ng/ml。0~100000ng/ml范围内有效。2.5似物与麻黄的交叉反应实验结果表明,赭曲霉毒素A的结构类似物赭曲霉毒素B、桔霉素与赭曲霉毒素A快速检测试纸条不产生交叉反应,赭曲霉毒素A快速检测试纸条的特异性较好。3胶体金属酶检测试纸条的结果目前,国内食品受生物毒素、农药、兽药污染问题严重,国家和政府对此已做了大量的投入,但执行情况仍不尽人意,造成该现象的主要原因之一是缺乏快速、灵敏、简便的检测方法。胶体金免疫层析法是在单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项速检测技术。赭曲霉毒素A快速检测试纸条利用的是抗原抗体特异性结合的原理。试纸条中含有底板和试剂吸附层。底板为不吸水薄片层,试剂吸附层固定在底板上,从加样处开始分别为样品垫、胶金垫、NC膜和吸水纸。在胶金垫上喷有金标抗体,在NC膜上喷有偶联了BSA的赭曲霉毒素A(检测线)和驴抗鼠的二抗(控制线),在控制线出现红线的前提下,根据检测线是否出现红色进行判断。样本中的赭曲霉毒素A在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合,抑制了抗体和NC膜检测线上赭曲霉毒素A-OV偶联物的结合。如果样本中赭曲霉毒素A含量大于10ng/ml,检测线不显颜色,结果为阳性。反之,检测线显红色,结果为阴性。如果控制线不出现红色,则说明整个试纸条失效。具体如图3所示。赭曲霉毒素A快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的方法,整个过程只需一步加样,10min内就能判定结果,