2024版高考生物总复习：基因工程生物技术的安全性与伦理问题热点专题13PCR技术及其应用课件

热点专题13

PCR技术及其应用[热点归纳]1.概念PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。2.PCR的原理(1)DNA分子的热变性原理。当温度超过90℃时，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。温度缓慢降低到50℃左右时，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性。DNA双链DNA单链(2)耐高温的DNA聚合酶。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。(3)关于引物。①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20~30个核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接接脱氧核苷酸，见下图：(4)PCR(体外的DNA复制)的条件。①控制温度，但不需解旋酶。②DNA模板。③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，还提供能量。④耐高温的DNA聚合酶。⑤分别与两条模板链相结合的两种引物。⑥需要在一定的缓冲液中进行。3.PCR的过程

(1)一般情况下，DNA模板链较长，需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。(2)第一轮循环，两引物与模板链互补，DNA分子模板链最长，新合成的DNA单链(含有引物的链)较短。(3)第二轮循环，以含有引物的母链为模板合成的DNA分子，会出现含有引物的DNA，其中新合成的单链b会比母链量更短，其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度，只是b为单链。(4)第三轮循环，以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。(5)结果分析。①两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循环次数的增加，目的基因含量会不断增加。②通过以上分析可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子)。③DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现，随着循环次数的增多，呈指数扩增。4.PCR的应用现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序等。【典例】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于________生物中，限制酶存在于该类生物中的主要作用是____________________________。

(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'—羟基与5'—磷酸间形成____________；PCR每次循环一般可分为__________________(按顺序书写)三步，其中第二步的目的是____________________________。原核切割外源DNA，保证自身安全磷酸二酯键变性、复性、延伸引物与两条模板DNA单链结合(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。

项目DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列

PCR引物①5'－AACTATGCGCTCATGA－3'②5'－AGAGGCTACGCATTGC－3'③5'－GCAATGCGTAGCCTCT－3'④5'－TCATGAGCGCATAGTT－3'③④(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____________。

A.5'－AACTATGCG…………..AGCCCTT－3'B.5'－TTGATACGC…………..CGAGTAC－3'C.5'－GCAATGCGT…………..TCGGGAA－3'D.5'－AATTCCATG…………..CTGAATT－3'D【解析】(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制酶，主要存在于原核生物中，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，进而在特定部位将双链DNA切开，显然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保证自身安全。(2)步骤Ⅱ用的是

DNA

连接酶，DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键，即催化相邻核苷酸之间的

3'—羟基与

5'－磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环包括变性、复性和延伸三步，该过程中升温到95

℃是为了使DNA变性解旋，进而获得DNA单链，其中第二步复性是指引物与两条模板DNA单链结合，进而为后续的延伸做准备。(3)由于DNA聚合酶只能从5'→3'方向催化子链延伸，根据碱基互补配对原则可知，引物①是以目的基因下边一条链的左端为模板向右侧延伸，引物②是以目的基因上边一条链为模板的右端向左侧延伸，引物③是以目的基因下边那条链的右端为模板向右侧延伸，引物④是以目的基因上边那条链的左端为模板向左侧延伸，本题的目的是要扩增已知序列两侧的未知序列，因此，应该选择引物③和④。(4)以下选项中，A、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要测定的是未知序列，故选D。解题指导熟知PCR扩增技术的原理、步骤和相关的技术流程是解答本题的关键，正确分析图示的信息是解答本题的前提，明确题意是解答本题的基础，掌握碱基互补配对原则是解答本题的法宝。[高考试练]1.(2021年广东深圳模拟)基因工程中，需要用PCR技术获取大量目的基因，通常是利用质粒作为载体，将目的基因送入细胞中，PCR技术和对质粒的改造是基因工程中重要的技术过程。回答下列相关问题：(1)PCR过程中加热至90~95℃以后，需要冷却到55~60℃，目的是______________________，在PCR反应体系中需要加入引物，加入引物的原因是_______________________________________________________。(2)一个DNA分子上有多个基因，现需要获取其中某一个基因作为目的基因，在引物设计时，要将2种引物设计在__________________，此时____________(酶)只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。

使得引物和模板结合DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链目的基因的上下游DNA聚合酶(3)通常用质粒作为基因工程的载体，作为基因工程载体的质粒需要满足一些条件，现有两种质粒：①质粒容易在物种之间转移，②质粒不能在物种之间转移，应该选择________(填序号)作为基因工程的载体。

(4)载体需要在受体细胞内能进行复制，同时能够控制自身复制，阐述控制自身复制的目的：__________________________________________。

使目的基因在宿主细胞内保持相对适宜的水平①【解析】(1)PCR由变性、复性、延伸三个基本反应步骤构成，PCR中冷却到55~60

℃，这一步叫复性，目的是使得引物和模板结合。引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链，因此在PCR反应体系中需要加入引物。(2)利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增，一个DNA分子上有多个基因，现需要获取其中某一个基因作为目的基因，在引物设计时，要将2种引物设计在目的基因的上下游，此时DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。(3)质粒作为基因工程常用载体必须具备的三个条件：①能在宿主细胞内复制并稳定保存，②具有多个限制酶酶切位点方便剪切，③具有标记基因，有利于检测。基因工程是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，因此载体需要容易在物种之间转移，因此应该选择①作为基因工程的载体。(4)载体需要在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，同时能够控制自身复制，不能使目的基因过度复制，也不能让目的基因过少，因此控制自身复制的目的是使目的基因在宿主细胞内保持相对适宜的水平。2.(2022年河北秦皇岛检测)常见的新冠病毒的检测方法是新冠病毒核酸检测，原理为实时荧光定量PCR(RT－PCR)检测法，技术流程如下图所示，①②③表示相关步骤。请回答：(1)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是______________。

RT－PCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加____________酶。

(2)过程①中，RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是____________________________。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理，其目的是________________________________。步骤③需要的酶是______________，引物F和引物R是根据____________________________序列合成的。

半保留复制逆转录蛋白酶K能催化病毒蛋白质水解提高样本转运和检测阶段的安全性TaqDNA聚合酶一段已知的新冠病毒RNA的碱基(3)在进行新冠病毒核酸检测时，通常以病毒的ORF1b基因为检测的目标基因，是因为ORF1b基因具有____________________________________的特点。

特异性强、基因结构相对稳定(变异小)【解析】(1)PCR技术与DNA体内复制的复制方式都是半保留复制。RT－PCR过程中cDNA的合成为逆转录过程，