解磷细菌4的分离筛选及解磷能力研究

解磷细菌4的分离筛选及解磷能力研究

磷酸是植物生长所必需的三个养分之一。中国土壤的总磷含量一般为0.02%0.11%，但可以直接吸收的有效磷含量一般不超过总磷含量的5%。大多数磷与土壤结合，如钙、磷、铁、磷和al3。这是一个很难分解的磷酸。因此，全国74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷是无效的磷。解磷菌可以将土壤中易分解或分解的磷转化为易植物吸收的磷，提高土壤的磷含量，增加作物的磷含量，提高作物的产量。同时，它可以促进植物根系硫、铜等养分的吸收，提高植物的抗逆性，减少污染。因此，利用解磷菌制备的细菌产品具有很大的开发和应用价值。在前苏联、东欧、印度、加拿大、中国等前苏联、东欧、印度、加拿大、中国等前苏联、东欧、黄褐色、卡其色、假单胞菌、假单胞菌、土壤侵生细菌、真菌、真菌、微生物等。目前，我国一些土壤和植物种类的解磷酶抑制剂的形成机制不同，而且复杂，主要包括解磷酶、乙酸、磷酸酶等药物，以及过度磷酰胺等。目前，我国一些土壤和植物种类的解磷酶诱导剂的产生率不同，主要是通过某些地区的水果、蔬菜、花卉、中药、小麦等作物生产而获得的。然而，关于促进水稻生产力的药物结磷酶的报道很少。红壤广泛分布于中国南部和中部的热带和亚热带地区,面积113万km2,占国土面积的11.8%.在红壤地区种植的主要农作物是水稻,该地区的稻米产量占全国的80%,并养活着全国22.5%的人口.酸、粘、瘠、旱是红壤的主要肥力特征.红壤对磷有强大的吸附固定力,磷肥易被土壤中活性铁、铝固定而使大多数有效态磷转化为各种形态的非有效磷,从而大大降低磷肥的利用率.施用磷肥时间愈久,其肥效愈低.因此,如何充分利用溶磷微生物来溶解积累于土壤中的磷源、提高磷的利用率,一直是农学、土壤学及生态环境工作者所关注的问题.本研究从江西鹰潭红壤稻田采集土样,分离筛选适合酸性红壤性水稻土应用的高效土著解磷细菌,并对其培养条件进行优化,制成菌肥施用于有效磷含量较低的酸性红壤稻田,以期发挥其高效解磷作用、提高红壤稻田磷肥利用效率、部分代替无机磷肥并促进水稻增产.1材料和方法1.1磷、溶解ca3po42的量枯草芽孢杆菌,徐州华龙高效复合菌剂厂提供,其降解有机磷、溶解Ca3(PO4)2的量分别为107.4mgL-1、163.9mgL-1;溶解AlPO4的能力较弱,仅为2.1mgL-1.在本研究中作为对照.1.2微生物分离和复筛从位于江西鹰潭的中国科学院红壤生态试验站(28°15′30″N,116°55′30″E)稻田耕作层土壤(0~15cm)中分离筛选微生物.分离筛选用培养基分别为无机磷培养基和有机磷培养基.选取分离培养基上透明圈与菌落直径比值(HD/CD)较大的菌株进行液体发酵试验复筛.1.3菌株鉴定及pcr扩增形态学和生理生化鉴定:取合适稀释度的细菌纯培养菌液涂平板,30℃恒温培养.待长出菌落后,观察菌落的大小、颜色等特征.革兰氏染色,显微镜观察个体形态.另外,进行葡萄糖发酵、柠檬酸盐试验、硫化氢试验、接触酶检验等生理生化鉴定.分子生物学鉴定:提取和纯化菌体DNA,用细菌通用引物BSF8(5’-TATCCTATGCCTTACACTTC-3’)和BSR1541(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)扩增16SrDNA.PCR反应体系(50μL)为5μL10×PCR缓冲液,0.2mmol/LMgCl2(25mmolL-11.4菌种生物量的测定在250mL三角瓶中分别加入50mL无机磷、有机磷液体培养基,接种1mL菌悬液,对照用1mL无菌水代替菌悬液,在30℃,150rmin-1下分别振荡培养7d和5d.所有处理进行3次重复.通过鉴定菌液D440nm评价菌体生物量;将培养液在6000rmin-1下离心20min,通过钼蓝比色法测定上清液中有效磷含量来评价解磷量.1.5土壤有效磷的测定采集江西鹰潭余江县红壤性水稻土,风干并过2mm筛该土壤母质为第四纪红粘土(Quaternaryredclay),基本化学性质为pH(H2O)5.2~5.3、全氮1.69gkg-1、全磷0.35gkg-1、全钾33.2gkg-1、有机质32.1gkg-1、速效氮145.4mgkg-1、有效磷5.21mgkg-1、速效钾91.5mgkg-1.主要的氧化物为氧化铁(游离氧化铁约49%)和氧化铝(游离氧化铝约10%).设灭菌与不灭菌两组处理,土壤灭菌采用24h内间歇灭菌3次,每次121℃、1h.各处理称取200g土装入500mL玻璃瓶中,加入菌剂10g(有效活菌数≧2亿个g-1),调节土壤水分为田间最大持水量的60%.置于28℃下培养,分别在d7、d15、d25、d35、d45、d55采样测定土壤有效磷含量.所有处理进行3次重复.1.6细菌剂的生产和陆地社区试验1.6.1解磷菌的活性将筛选获得的高效解磷菌株在徐州华龙高效复合菌剂厂生产,拌加草碳(有机质含量50%~70%,腐植酸含量20%~40%,含氮、磷、钾总量大于3%)制成固体菌剂.菌剂中解磷菌有效活菌数≧2亿个g-1,有效磷及总磷的含量分别为0.61mgkg-1、0.35gkg-1.1.6.2土壤理化性质2009年在江西鹰潭早稻、晚稻田中布置试验小区,施用研制的菌剂.早稻、晚稻田间小区各设4个和3个试验处理(表1),每个处理设3次重复.早稻小区面积为11.4m×5.5m=62.7m2.土壤母质为第四纪红粘土,基本化学性质为pH(H2O)5.3~5.4,全氮1.51gkg-1、全磷0.35gkg-1、全钾33.8gkg-1、有机质31.2gkg-1、速效氮142.8mgkg-1、有效磷4.87mgkg-1、速效钾88.2mgkg-1.晚稻小区面积14.08m×11.4m=160.5m2,土壤基本化学性质同1.5.早、晚稻中化肥(单肥)和菌剂施用量见表1,其中单肥作基肥和追肥施用,早稻中菌剂作追肥施用,晚稻中菌剂做基肥施用.1.7数据处理及分析用SPSS16.0forWindows对不同利用方式之间的数据进行相关性分析、方差分析(ANOVA),差异水平通过邓肯法检验;运用MEGA4.0对测定所得DNA序列分析、绘制系统发育树.2结果与分析2.1t4溶解alpo4和磷矿粉的能力从江西红壤性水稻土筛选到解磷细菌11株,溶解AlPO4的能力介于101.3~334.2mgL-1之间,其中菌株T4溶解AlPO4和磷矿粉的能力最高,分别为334.2mgL-1、193.1mgL-1.与徐州华龙高效复合菌剂厂生产用解磷菌X3的解磷能力相比,T4溶解AlPO4、磷矿粉的能力较X3强(表2).2.2菌株t4的识别2.2.1基因型菌株的鉴定结果菌株T4在固体解磷培养基上培养,菌落颜色为乳白色,中间凸起,无同心圈,表面光滑,无光泽,生理生化鉴定结果为革兰氏阴性菌,显微镜观察(×1000)结果显示细胞形态为杆状,不运动(图1).革兰氏染色、葡萄糖发酵、柠檬酸盐试验、硝酸盐试验、接触酶、卵黄反应试验等呈阳性,硫化氢试验、V.P试验呈阴性,初步生理生化鉴定该菌株属于伯克霍尔德菌属.2.2.2srdna分析通过测定菌株T416SrDNAPCR产物序列,获得序列信息与GenBank核酸数据库中其它的16SrDNA序列进行同源性比较,用MEGA4.0软件构建T4的16SrDNA系统进化树(图2),将菌株T4鉴定为伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.).2.3菌株t4的降解磷能力不同碳源对菌株T4的生长及解磷都影响较大,所试验的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉等几种碳源中,最适合菌株Y8生长和解磷的碳源为乳糖.不同氮源对菌株T4的解磷液影响较大,硫酸铵、硝酸钾、尿素、蛋白胨几种氮源中,最适合菌株T4生长和解磷的氮源为硝酸钾;当提供的氮源为尿素时,基本不解磷.菌株T4对pH有较广的适应范围,在pH4.0和11.0时仍具有解磷能力,最适pH为7.0~8.0.菌株T4菌体量及解磷量在20~35℃范围内随温度升高而增加,超过35℃时,菌体量及解磷量开始下降;最适温度为35℃左右.根据单因素的实验结果,按正交设计表[L9(34)]进行试验,优化菌株T4的解磷培养条件.最优组合为:乳糖15gL-1,KNO31.0gL-1,pH为7.0,温度为30℃,此时溶解AlPO4的量为806.3mgL-1.最佳培养条件下菌体生长和解磷曲线见图3.实验显示,随着时间的增加,菌体量与解磷量逐渐增多且成正相关,培养48h后菌液pH下降,并且开始具有解磷能力,pH与解磷能力呈反相关;培养至120h后D440nm、pH及解磷量基本稳定(图3).2.4不添加菌剂对土壤解磷效果的影响红壤性水稻土接入菌剂T4于28℃培养7d以后,未灭菌处理、灭菌处理土壤有效磷含量比未接菌土壤分别增加了3.78mgkg-1、2.48mgkg-1(图4).未灭菌处理结果显示,添加菌剂T4在短期(15d)内解磷效果明显,比未接菌土壤和接种X3对照解磷量分别增加93.4%和32.5%.2.5农田测试2.5.1不同化肥用量对水稻产量的影响在早稻育秧秧田施用菌剂,秧苗生长较为粗壮,与未施菌剂对照相比效果明显.田间小区试验表明,施用菌剂可在不降低水稻产量的情况下减少化肥用量(图5):在施用菌剂T475.0kg/hm2、常规N、K肥和70%P肥的情况下(处理4),可获得施常规化肥(处理1)的水稻产量,比施常规N、K肥和70%P肥的对照(处理2)产量提高将近11.6%.2.5.2不同施肥量的产量结果在2009年种植的农香98晚稻小区,施用菌剂T475.0kg/hm2和施常规氮、K肥的处理(处理3)与不施磷肥、仅施常规氮、钾肥的对照(处理1)相比,平均产量提高7.5%;与当地常规施肥处理(处理2)的产量相比低1.9%,但未达到统计上显著差异(图6).说明解磷菌剂可起到代替大部分磷肥的作用.3菌株t4的生物活性及菌肥施用本研究得到的解磷细菌为伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.).已报道的解磷细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)、土壤杆菌(Agrobacterium)、伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)、黄杆菌(Flavobacterium)等.现有研究较多关注溶解Ca3(PO4)2的解磷菌,本研究旨在筛选适合红壤应用、能溶解红壤中含量较高的特征性磷酸盐AlPO4及磷矿粉的解磷细菌,获得的菌株T4较赵小蓉等获得的解磷细菌、徐州华龙高效复合菌剂厂生产用解磷菌X3(表2)和我们筛选获得的另一菌株Y8相比,溶解AlPO4及磷矿粉的能力较高,同时T4还具有一定的溶解Ca3(PO4)2的的能力,因此菌株T4具有较好的综合解磷能力,有望成为开发红壤高效微生物磷肥的优良微生物资源.对T4的解磷条件研究发现,不同碳源对菌株T4生长及解磷量影响较大,菌体量与解磷量存在相关性(图3),这与现有的一些报道不同,这些报道认为不同碳源对解磷菌生长影响不大,且菌体生长量与其解磷量没有明显相关性[21~22]如Narsian等发现解磷菌Aspergillusaculeatus能利用11种不同的碳源物质,其中以阿拉伯糖、葡萄糖为碳源时解磷活性最高,并且发现菌体生长量与其解磷量之间没有明显的相关性,其原因可能与糖类不同的结构有关,菌体更适宜利用某种结构,需要的酶越少,过程越简单,从而可能更易产酸.氮源物质可以改变解磷微生物产有机酸或释放H+的溶磷机制,改变其溶磷能力.本研究显示不同氮源对菌株T4的解磷量影响很大,氮源为硝酸钾时解磷量最高,当提供的氮源为尿素时基本不解磷,这与现有报道也不相同,如有的报道表明氮源为硫酸铵时的解磷量是硝酸钾时的80多倍.大多数研究表明铵态氮是溶磷微生物的必需氮源,对铵态氮有依赖性,甚至依靠吸收铵态氮分泌出H+质子溶磷[24~25].室内培养条件下对红壤性水稻土的解磷效果研究显示,接种菌株T4可使未灭菌处理、灭菌处理土壤有效磷含量分别增加3.78mgkg-1、2.48mgkg-1,与现有资料报道相比,显示出T4在红壤中具有较好的溶解磷的作用.菌株T4是江西红壤土著解磷细菌,具有较高的溶解AlPO4、磷矿粉的能力.在江西鹰潭进行的初步大田小区试验结果显示菌株T4具有代替一部分化肥的作用,即菌株T4制成微生物菌肥施用于水稻田可减施磷肥30%而不致水稻减产.从试验土壤的理化指标看,试验小区土壤的有效磷含量较低而有效氮含量相对较高[27~28],土壤中有效磷相对缺乏,施用菌剂可使土壤中部分被固定的磷转化为易于被植物吸收利用的有效磷而被作物吸收利用,这样减施磷肥30%而不致水稻减产.本研究显示,土壤中有效磷相对缺乏是菌肥发挥肥效的前提,但是另一方面,在稻田中施过多的菌剂也未能使水稻进一步增产,施菌剂比施化肥将使种稻成本略有提高,根据初步大田小区试验结果,每亩施用菌剂5~7kg而减施磷肥30%将增加费用50~80元/亩.从早、晚稻田施用菌肥效果看,T