第四章 蛋白质的共价结构

第四章

蛋白质的共价结构Protein蛋白质-英文为“Protein”

——第一重要

本章重点内容肽和肽键的结构蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构和生物学功能一、蛋白质的化学组成和分类1、蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有C、H、O外，还有N和少量的S、P

。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是P、Fe、Cu、Co、Mn、Zn等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50％氢7％氧23％氮16%

硫0—3％其他微量2、蛋白质的含氮量☆蛋白氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：☆蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数

6.253、蛋白质的大小与分子量

蛋白质是分子量（Mr）很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。4、蛋白质的分类什么叫单纯蛋白质、缀合蛋白质？辅基（或配体）？分类方法；球状蛋白质、纤维状蛋白质、膜蛋白（质）；单体蛋白质、寡聚蛋白质、亚基（亚单位）；二、蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质

结构一级结构基本结构（初级）二级结构三级结构四级结构空间结构高级结构空间构象

在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。蛋白质的功能与分布单细胞生物胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、酶蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（催化遗传）多细胞生物个体层次毛发、皮肤——角蛋白骨骼、牙齿——钙+胶原蛋白蛋白质分布广泛、功能多样1.催化功能-酶2.结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架3.载运功能-膜蛋白4.调控功能-激素5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神经传导基本功能辅助功能氨基酸的连接方式——肽键(peptidebond)三、肽蛋白质——多聚氨基酸肽键(酰胺键)（一)肽和肽键

一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。多肽链（polypeptidechain)

1、氨基末段（-NH2）和羧基末端（-COOH）

2、命名：“某氨基酰某氨基酰•

•

•

•

•

•某氨基酸”

3、肽链和肽键；主链和侧链；氨基酸残基

4、二硫键、链内二硫键和链间二硫键在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的

-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的

-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

很多多肽都采用俗名，如催产素、胰岛素等。（二）天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类通常具有特殊的生理功能的多肽，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。短链且具有生物功能的多肽不算蛋白质，通常称为活性肽！垂体后叶分泌的催产素（9肽，促使妊娠子宫收缩）、加压素（9肽，升高血压）等。一些抗生素（antibiotics）也是肽或肽衍生物，如短杆菌肽S。放线菌素（actinomycinD，国产品称更生霉素Dactinomycin,DTM）是从链霉菌属中分离出的，它可以与模板DNA结合抑制转录，从而抑菌，临床上用于恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等，但毒性大，使用少。一些蕈（mushrooms）产生的巨毒毒素也是肽类化合物，如α-鹅膏蕈碱是从鹅膏蕈属（或捕蝇蕈属）（Amanitaphalloides）分离的环状八肽，它能与真核细胞的RNA聚合酶（RNApolymerase）Ⅱ牢固结合，使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA合成。脑啡肽是具有吗啡作用的5肽长度的活性肽，其功能不太清楚，但目前在神经生物学和神经精神病学中的研究前景广阔。

肌肉中的鹅肌肽（β-丙氨酰-1-甲基组氨酸）和肌肽（β-丙氨酰组氨酸），在骨骼肌中的含量很高，达20~30mmol，但其功能至今尚不清楚，估计与肌肉收缩有关。谷胱甘肽（glutathione,GSH）：是一种称为

-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。Glu-Cys-Gly|

S|S|Glu-Cys-Gly谷胱甘肽分子中的巯基可氧化或还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。2×Glu-Cys-Gly|

SH-2H+2H★解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；★参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；★保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；★维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。谷胱甘肽的生理功用：

蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。四、蛋白质的一级结构的测定蛋白质一级结构（primarystructure)：是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方式和排列顺序，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是肽键和少量的二硫键。研究意义

1、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质的人工合成奠定了物质基础。

2、诊断遗传病、合成基因探针等高新技术的研究具有重要意义。

我国1965年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素。胰岛素（Insulin）：

由胰岛β-细胞分泌的含N类激素。结构上由51个AA残基所组成，可分为A、B两条链。A链含有21个AA残基，B链含30个AA残基。A、B两链之间通过两个二硫键联结在一起，A链还含有一个链内二硫键。

蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

蛋白质一级结构的测定①.多肽链数目的测定根据蛋白质N端和C端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定分子中的多肽链数目。若含一条多肽链，蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等；如果后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链组成。如果检测到的末端基多于一种，表明蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成，即样品是杂多聚蛋白质（heteromultimericprotein）。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体②.拆分蛋白质的多肽链寡聚蛋白质的亚基必须拆分。可用变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理。③.拆开多肽链内的二硫桥若亚基间通过二硫桥（S-S）交联，如胰岛素（含两条多肽链）和α-胰凝乳蛋白酶（含3条多肽链）则可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的

-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。④.测定每一条多肽链的氨基酸组成分离纯化的多肽链一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，计算氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。现在已有氨基酸自动分析仪和蛋白质序列仪，对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方便。⑤.鉴定多肽链的N端和C端残基多肽链的另一部分样品进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。⑥.裂解多肽链成较小的片段用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不一样）将每条多肽链样品降解成两套或几套重叠的肽段或称肽碎片。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。⑦.测定各肽断的氨基酸序列最常用Edman降解法，并有自动序列分析仪可供利用，此外尚有酶解法和质谱法等。以氨基酸自动测序仪分析，一个分子量在3万的蛋白质，仅需6ug样品，1小时即可测定完毕。⑧.建立完整多肽链的一级结构利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠可以拼凑出原来的完整多肽链的氨基酸序列。⑨.确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置氨基酸序列测定中不包括辅基成分分析，但是它应属于蛋白质化学结构内容。N端测定二硝基氟苯（DNFB或FDNB，sanger试剂）法DNFB与AA的α-NH2的反应被广泛用于测定N-末端AA。多肽或蛋白质的游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质对酸水解比肽键稳定，因此DNP-多肽经酸水解后，只有N-末端AA为黄色DNP-AA衍生物，其余的都是游离AA。用有机溶剂（如乙酸乙酯）将DNP-AA抽提出来，再运用纸层析、薄层层析或HPLC进行定性和定量分析，便可得知多肽链的N-末端残基。此法的缺点是所有的肽键都被水解掉了。丹磺酰氯（dansylchloride，DNS）法丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称，原理与DNFB法相同。丹磺酰基有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，且水解后的DNS-AA不需提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）法多肽和蛋白质的末端氨基和AA的α-NH2能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，称PTC-多肽或蛋白质，它在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-AA环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱下，除去N端AA的肽链仍然完整。代表N端残基的PTH-AA经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析（如硅胶薄膜或聚酰胺薄膜）、气相色谱和HPLC鉴定。除N端的氨基酸外，其余多肽链会保留下来，可以继续不断的测定其N端。C端测定肼解（hydrazinolysis）法

C端测定的重要方法。所有的肽键（酰胺）都与肼反应而断裂成酰肼，只有C端的氨基酸有游离的羧基，不会与肼反应成酰肼。即，与肼反应后仍具有游离羧基的氨基酸就是多肽C端的氨基酸羧肽酶（carboxypeptidase）法有效和常用。专一性从C端逐个水解出游离AA，被释放的AA数目与种类随反应时间而变化，由此推测C端氨基酸序列。几个氨基酸释放速度相近或两个相同氨基酸毗邻时，小心结果。外肽酶：分别从肽链羧基端和氨基端水解羧肽酶和氨肽酶Trypsin：只水解羰基属于赖氨酸、精氨酸的羧基参与形成的肽键。水解位点胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢水解位点糜蛋白酶Pepsin：R2苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr等疏水氨基酸残基的氨基端肽键亮氨酸Leu以及