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文档简介
5.菊花的组织培养植物细胞一般具有全能性。在一定的激素和营养等条件的诱导下,已经分化的细胞可以经过脱分化,即失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞,进而形成不定形的薄壁组织团块,这称为愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官,该过程称为再分化。植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素,它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上,就可以诱导其再分化成胚状体,长出芽和根,进而发育成完整的植株。目的要求(1)了解植物组织培养的基本原理。(2)了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量的比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响。(3)尝试进行植物组织培养。材料用具(1)用具:50mL锥形瓶(或植物组织培养瓶)、烧杯、酒精灯、超净工作台(或接种箱)、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、封口膜、滤纸、标签、消毒用酒精棉球、培养皿、解剖刀和镊子等。(2)材料:幼嫩的菊花茎段、培养基、体积分数为70%的酒精、质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液和无菌水等。各种培养基的配制参见本书附录1。(3)植物组织培养实验常用培养基的配方和配制方法MS培养基的配方(1L的用量)成分用量(mg)成分用量(mg)NH3NO3(硝酸铵)1650KNO31900KH2PO4(磷酸二氢钾)170MgSO4•7H2O370CaCl2•2H2O(二水合氯化钙)440MnSO4•4H2O22.3ZnSO4•4H2O8.6H3BO3(硼酸)6.2KI0.83Na2MoO4•2H2O0.25CuSO4•5H2O0.025CoCl2•6H2O0.025甘氨酸2盐酸硫胺素(VB1)0.1盐酸吡哆醇(VB6)0.5盐酸0.3肌醇100蔗糖30琼脂10螯合铁岩配制各种母液。配制时,无机物中大量元素浓缩10倍,微量元素浓缩100倍(MS培养基的配方参见上表)。激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/mL的质量浓度单独配制成母液。用母液配制培养基时,需要根据各种母液的浓缩倍数,计算用量。将称好的琼脂加入800mL蒸馏水中,加热使琼脂化,然后加入蔗糖30g,取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液,依次加入,再加蒸馏水定容至1000mL,并调节pH诱导菊花念伤组织的培养基:在MS培养基中加入BA(苄氨基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸),质量浓度均为0.5mg/L。诱导菊花生芽的培养基:在MS培养基中加入BA和NAA,质量浓度分别为2~3mg/和0.02~0.3mg/L。诱导莉花生根的培养基:将上述MS培养基中NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4•7HO和CaCl•2H2O的用量减半,并添加NAA或IAA(吲噪乙酸),质量浓度均为0.1mgL。方法步骤(1)消毒:用酒精擦拭双手和超净工作台台面。将流水充分冲洗后的外植体(幼嫩的茎段)用酒精消毒30s。然后立即用无菌水清洗2~3次;再用欧氯酸钠溶液处理30min后,立即用无菌水清洗2~3次。(2)外植体切段:将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中,用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5~1cm长的小段。(3)接种:在酒精灯火焰旁,将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口,并在培养瓶上作好标记。*接种操作应在酒精灯火焰旁进行,但注意塑料的瓶口不可灼烧;*接种时,注意外植体的方向,不要倒插(应使形态学下端接触培养基)思考问1.为什么整个过程要保证无菌操作?提示:避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养,同时防止有些杂菌危害培养物的生长。问2.为什么外植体不能倒插?(了解)提示:与生长素的极性运输有关;生长素含量多的部分容易生出不定根,含量少的部分生出不定芽,一般而言,容易长不定芽的是形态学上端,容易长不定根的是形态学下端,因此应该将形态学上端朝上,下端朝下,若倒插,外植体不易存活。(4)脱分化:将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中,定期观察和记录愈伤组织的生长情况。*该过程一般不需要光照;*有光易形成维管组织,不易形成愈伤组织;(5)再分化:培养15~20d后,将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后,将其转接到诱导生根的培养基上,进一步诱导形成试管苗。*注意顺序,先诱导生芽,再诱导生根;*该过程每日需要给予适当时间和强度的光照;(6)移栽培养:移栽前先打开封口膜或瓶盖,让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后,将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况,适时浇水、施肥,直至开花。注意(1)实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行,并且每次使用后的器械都要灭菌。(2)接种时注意外植体的方向,不要倒插。(3)诱导愈伤组织期间一般不需要光照,在后续的培养过程中,每日需要给予适当时关于间和强度的光照。结果分析与评价(1)接种3~4d后,检查外植体的生长情况,统计有多少外植体被污染,有多少能正常生长,并分析它们被污染的原因。提示:用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长,如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染,就会导致实验前功尽弃,因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能有:培养基、接种工具灭菌不彻底;外植体消毒不彻底;操作过程不符合无菌操作要求等。(2)你培养出愈伤组织了吗?如果培养出来了,从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天?这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗?提示:观察实验结果,看看是否培养出了愈伤组织,记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。(3)观察外植体的分化情况,填好结果记录表,并及时分析结果。提示:做好统计和对照,填好结果记录表,培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录,可以分组配制不同的培养基,如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等,还可以进行不同配方的比较。(4)你培育的幼苗移栽到露地后,能够正常生长吗?提示:生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基,又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒,可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾,并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天,待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率,看看移栽是否合格。(5)若要得到大量的菊花幼苗,该如何进行?请画出简图。提示:生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基,又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒,可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾,并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天,待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率,看看移栽是否合格。进一步探究(1)一般来说,容易进行无性繁殖的植物也容易进行组织培养,如芦荟、秋海棠
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