蛋白质的化学组成

第五章蛋白质蛋白质的化学组成氨基酸蛋白质的结构蛋白质的性质蛋白质在加工贮藏中的变化蛋白质的测定5.1蛋白质的化学组成组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N、S和P，

有些蛋白质还含有微量金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还含有I

。存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。

5.2氨基酸

1.构成蛋白质的20种氨基酸氨基酸的结构通式R氨基酸的分类

I脂肪类氨基酸

II芳香族氨基酸III杂环族氨基酸

2.氨基酸的重要理化性质

物理性质

(1)溶解度：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。

(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。

(3)旋光性：除甘氨酸外其他氨基酸分子内至少有1个不对称碳原子，因此具有旋光性

(4)味感：氨基酸味感与立体构型有关，D-氨基酸多带甜味，D-色氨酸甜味最强

氨基酸的化学性质氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。（1）等电点(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子氨基酸的化学性质（2）与金属离子的整合作用（3）脱氨基、羧基反应（4）褐变反应（5）茚三酮反应在氨基酸分析中具有特殊意义的反应

茚三酮反应茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，氨基酸被氧化成醛、CO2和NH3，最后茚三酮与反应产物──氨和还原茚三酮发生作用，生成蓝紫色化合物。

两个亚氨基酸──脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物。OH羟NH3CO2RCHO+还原性茚三酮+(弱酸)加热3H20氨基酸与茚三酮反应水合性茚三酮+2NH3+水合性茚三酮还原性茚三酮蓝紫色化合物

5.3蛋白质的结构蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)一级结构

二级结构三级结构四级结构定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键一、蛋白质的一级结构2.一级结构的意义一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。目录二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的化学键：

氢键

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;

每个aa残基沿轴旋转100度.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。绝大多数天然蛋白质中的

-螺旋几乎都是右手螺旋。

-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。

-螺旋及结构特点1.

-螺旋螺距0.54nm每残基的轴向高度0.15nm每残基绕轴旋转100o2.

-折叠（

-pleatedsheet）

-折叠或

-折叠片也称

-结构或

-构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。

-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象

-折叠

-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直。

-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反

-折叠的特点3.-转角和无规卷曲

-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。无规则卷曲示意图细胞色素C的三级结构无规则卷曲１）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：αα；ββ；βαβ；βββ．

★超二级结构（在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域）ααβββαβ超二级结构和结构域超二级结构类型

X

纤维蛋白分子的结构域2）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)

。结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。

2）结构域类型：

α-螺旋域；β-折叠域；α+β域；

α/β域；无规则卷曲+β-回折域；无规则卷曲+α-螺旋结构域结构域1结构域2

-折叠

-转角二硫键

-螺旋卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和范德华力等。

主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义维持蛋白质三级结构的作用力氢键：x—H…y疏水作用力：是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的集合力范德华力：在物质的聚集状态中，分子与分子之间存在着一种较弱的作用力离子键：它是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成的二硫键：是两个硫原子之间所形成的共价键目录β-折叠β-转角无规则卷曲

空穴α-螺旋2、三级结构的特征：

含多种二级结构单元；

有明显的折叠层次；

是紧密的球状或椭球状实体；

分子表面有一空穴(活性部位)；

疏水侧链埋藏在分子内部，

亲水侧链暴露在分子表面。实例：肌红蛋白肌红蛋白血红素辅基

肌红蛋白(Mb)

N端

C端抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构四、蛋白质的四级结构

四级结构是指由两个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为亚基。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连亚基单独存在时无生物学活性。一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。1.定义2.维持蛋白质四级结构的主要作用力在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。疏水键是最主要的作用力。血红蛋白四级结构血红素辅基化学键共价键次级键肽键二硫键氢键疏水键盐键范德华力一级结构二、三、四级结构三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键血红蛋白的四级结构

蛋白质结构与功能的关系第三节一级结构是空间构象的基础

牛核糖核酸酶的一级结构二硫键蛋白质一级结构与功能的关系研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。

2.蛋白质一级结构的变异与分子病

分子病—指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。镰刀形贫血病：病因：血红蛋白AA顺序的细微变化

-链N端氨基酸排列顺序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。正常红细胞镰刀形红细胞正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图

谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，溶解度降低，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血.镰刀型贫血病（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构蛋白质空间结构与功能的关系一、两性解离性质及等电点二、蛋白质胶体性质三、蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质的紫外吸收特性六、蛋白质呈色反应第六节蛋白质的重要性质（一）蛋白质的两性电离

蛋白质的理化性质

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。(二)蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内，由于蛋白质的分子量很大它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白小分子杂质除去。

*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉蛋白质胶体性质的应用

由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

*蛋白质的变性(denaturation)蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素的作用下，能够破坏蛋白质的特定空间构象，引起蛋也即有序的空间结构变成无序的空间结构，蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.

造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。蛋白质沉淀

蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。可逆沉淀定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。不可逆沉淀定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。盐析

在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：

破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）

用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。

有机溶剂沉淀法：

在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：

破坏蛋白质的水化膜。注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。重金属盐沉淀(条件：pH稍大于pI为宜)

当pH稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。

加热变性沉淀法

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。

当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速.

如：煮鸡蛋酶的制备：超氧化物歧化酶的提取蛋白质的变性与复性

A、蛋白质的变性定义天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。引起蛋白质变性的主要因素1.物理因素：加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等2.化学因素：强酸、强碱、脲、去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS））、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。蛋白质的变性后的表现生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。

组分和分子量不变。蛋白质变性的本质：

分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。

变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。

蛋白质的复性

定义：如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后，可根据热力学原理缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象，这种现象称作复性。电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml

蛋白质的紫外吸收

蛋白质的颜色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。蛋白质的颜色反应

双缩脲反应酚试剂反应

蛋白质定量、定性

茚三酮反应

测定常用方法

另外还有：蛋白黄色反应、米伦氏反应、乙醛酸反应等。1.按组成成分分A.单纯蛋白质－－单纯蛋白不含有非蛋白质部分。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。

单纯蛋白质按其溶解性又可分为:清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等二、蛋白质的分类

B.结合蛋白质－－结合蛋白是指由单纯蛋白和非蛋白成分结合而成的蛋白质.

按其非氨基酸成分又可分为：

核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、糖蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白、金属蛋白2.按分子的形状或空间构象