脂肪酶发酵条件优化

一、 实验仪器及药品仪器：显微镜、血球计数板、旋转式恒温摇床、电子天平、pH计、生化培养箱、低速离心机、高速离心机、离子交换柱、透析袋、磁力搅拌器药品：NaCl、琼脂粉、蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4-2H2O.酵母浸膏、(NH4)2SO4、MgSO4-7H2O、蔗糖、橄榄油、聚乙烯醇(PVA)、NaOH、邻苯二甲酸氢钾(C8H5O4K)、硫酸铵、95%乙醇、氯化钡、三羟甲基氨基甲烷(Tri)、DEAE-SepharoseFF、浓HCl、酚酞二、 培养基及试剂的配制培养基的配制：斜面培养基(g/l)：琼脂20.0、蛋白胨5.0、NaCl3.0、K2HPO41.0＞酵母浸膏5.0。种子培养基(g/l)：蛋白胨5.0、蔗糖5.0、NaCl3.0、K2HPO42.0,酵母浸膏5.0。发酵培养基(g/l)：蛋白胨20.0、蔗糖5.0、橄榄油5.0、(NH4)2SO41.0、MgSO4-7H2O1.0、K2HPO41.0。加蒸馏水1000ml,加热溶解，分装后121°C灭菌30min。试剂的配制：、2%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取20g聚乙烯醇图物)放入800mL蒸馏水中，边搅拌边加热，使其完全溶解，自然冷却后加蒸馏水定容至1000ml，然后用双层纱布过滤，保存滤液备用。、4%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取40g聚乙烯醇(PVA)，其他同上。、橄榄油乳化液：取橄榄油与聚乙烯醇(4%)按1:3比例混合，用高速组织搅拌机搅拌乳化3-5min，4C保存备用。、0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液：甲液：称取KH2PO417.01g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。乙液：称取Na2HPO4-2H2O44.77g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。吸取甲液13mL加乙液100mL，即成pH7.5，0.25mol/L磷酸缓冲液。以酸度计校正pH。使用时用蒸馏水稀释10倍，即成0.025M磷酸缓冲液。、0.05mol/LNaOH溶液：秤取NaOH2g，用500ml蒸馏水溶解，再定容至1000ml，用邻苯二甲酸氢钾标定。标定：精确称取105C干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾(C8H5O4K)0.5000g置250mL三角瓶中，加50ml煮沸后冷却的蒸馏水溶解，再加2滴1%酚酞指示剂(以95%中性酒精配制)以待标定的0.05mol/LNaOH滴定至微红色为终点。NaOH的浓度为N=W/(V*0.2042)式中W——邻苯二甲酸氢钾的克数；V——滴定消耗NaOH溶液的毫升数；0.2042——邻苯二甲酸氢钾的毫克摩尔数。、饱和硫酸铵溶液：秤取561g硫酸铵溶于1000ml蒸馏水中，溶解时加热以加速溶解，然后冷却吸取上清液即为饱和硫酸铵溶液。0.02mol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液：0.04mol/Ltris：秤取4.84gtris于烧杯，加500ml蒸馏水溶解，再定容至1000ml；0.04mol/LHCl：量取浓HCl(37.5%，12mol/L)3.33ml，加500ml蒸馏水溶解，定容至1000ml再用500ml0.04mol/Ltris与403ml0.04mol/LHCl混合，定容至1000ml既得。1、 菌种的活化用接种环接种一定菌体于斜面培养基的试管内，30°C培养2-3d，待细菌长出明显菌株，备用。2、 制备菌悬液将0.85%无菌NaCl溶液10mL加入上述活化的长有菌株的试管里，用接种环刮下菌体，用自制灭菌棉过滤。漩涡震荡得菌悬液，血球计数板计数，计算细菌浓度。3、 基准种子液的培养以1.0X107个/ml基准浓度为标准，每20ml种子培养基中接入200pl抱子悬液，30C、150r/min摇床培养24h后备用。4、 生长曲线的测定按接种量为2%(v/v)取液体种子于含有发酵培养基(25ml)的三角瓶中，以30C、150r/min下摇瓶培养3d。培养期间于6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h时分别取样，于4000r/min离心15min分别获得上清液与沉淀，沉淀获得菌体，并用pH计测定发酵液pH值。将菌体置于105C烘箱中，失水至恒重，测菌体干重。同时用上清液测定各个取样点的发酵液脂肪酶酶活。绘制生长曲线，确定获得最大酶活力时的培养时间。5、 脂肪酶活力测定(NaOH滴定法)：取2只100ml三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加PVA橄榄油乳化液4mL和0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液5ml(应把附在瓶壁上的乳化液冲下)，再于A瓶中加入95%乙醇15mL。置40C水浴内预热5分钟，然后在两瓶中各加入酶液lmL立即记时，反应15分钟后，在B瓶中立即加入95%乙醇15mL中止反应，加酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L标准NaOH滴定至微红色为终点，两组消耗的NaOH溶液分别为V「V2。对照样品的乙醇应在酶液前加入。酶活力定义：40C条件下，15min油脂水解反应，每min催化脂肪水解产生川mol脂肪酸的脂肪酶量定义为一个脂肪酶活单位(U/mL)。酶活力单位(U/mL)=(V]—V2)XNX25/作用时间(min) N--标定了的NaOH溶液的浓度。6、 摇瓶发酵实验以接种量2%(v/v)的液体种子接种于发酵培养基，在30C，150r/min进行发酵产酶试验(培养时间为生长曲线测定时得到的时间)，发酵液于4000r/min离心15min获得上清液，测定其脂肪酶酶活。7、 发酵培养条件的优化、接种量对菌株产脂肪酶的影响接种量的多少对微生物生长发酵周期和目标酶的产量都有较大影响。接种量偏小，生长周期缓慢，发酵周期延长，不利于产酶。接种量偏大，减少了培养基成分的有效利用率，使得发酵环境恶化，改变产酶时间及酶活水平。因此，恰当的接种量，不但可以缩短发酵周期，而且还能获得较高的产酶水平。实验分别以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的液体种子的接种量(V/V)接种发酵培养基。于30C，150r/min进行发酵产酶培养(培养时间为生长曲线测定时得到的时间)。发酵液于4000r/min离心15min获得上清液，分别测定其脂肪酶酶活，确定最佳接种量。、初始pH菌株产脂肪酶的影响初始pH作为微生物生存的外部环境之一，对其发酵也有一定的影响。使用 NaOH(0.1mol/L)或HCl(0.1mol/L)溶液，调整培养基的起始pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9之间。以（1）中确定的最佳接种量接种培养基，于30°C,150r/min进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。测定不同初始pH条件下摇瓶操作培养，收集发酵液，于4000r/min离心15min获得上清液，分别测定脂肪酶活力。确定最佳pH。（3）、发酵温度对菌株产脂肪酶的影响不同的发酵温度对微生物生长及代谢产物的分泌有很多的影响。实验按（2）中确定的最佳pH配制发酵培养基，以（1）中确定的最佳接种量接种培养基，分别于26C、28C、30C、32C、34C、36C条件下，150r/min进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。收集发酵液，于4000r/min离心15min获得上清液，分别测定脂肪酶活力。确定最佳培养温度。四、酶的分离纯化1、 发酵培养按上述发酵条件优化后确定的条件进行发酵罐发酵培养。2、 脂肪酶粗酶液的制备发酵液经过滤，4C、8000r/min离心15min，分别收集上清液（粗酶液）与沉淀备用。3、 测定脂肪酶酶活分别测定上清液及其沉淀蛋白（沉淀先用与上清液等体积0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液溶解再测酶活）的酶活。4、 硫酸铵盐析（1）、硫酸铉分级盐析分别取30ml粗酶液，加入饱和硫酸铉至饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%静置4h左右，并保证在低温条件下对粗酶液进行沉淀，便可得到不同饱和度下的蛋白质沉淀。分别测定上清液及其沉淀蛋白（沉淀先用与上清液等体积0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液溶解再测酶活）的酶活，确定硫酸铉沉淀最适饱和度。（2）、硫酸铉沉淀的透析除盐发酵上清液经硫酸铉沉淀后，取其有最大酶活沉淀用20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液充分溶解，沉淀溶解酶液经过20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液（缓冲液可再加少许0.1M的HCl）透析，低温慢速搅拌透析系统，隔4h换一次透析缓冲液，氯化钡检测透析液直至无白色沉淀产生，然后收集、离心（10000r/min，4C，30min）取上清，上清酶液冻干呈粉末状，再用少量20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液把可溶的蛋白溶解出来，从而达到浓缩富集效果。5、 DEAE-SepharoseFF离子交换层析、装柱：20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子。缓缓倒入DEAE-SepharoseFF湿胶约30ml，待分成后，倒去乙醇溶液，再次加入20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液。、平衡：装柱后，使用20mmol/LpH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子，速度约为1ml/min。平衡时间为5h以上，直至液相层析系统记录器显示为基准线。、上样和洗涤：脱盐浓缩后的蛋白质样品液5ml上样于离子交换柱。用20mmol/