sevag法去除当归粗多糖中的蛋白质

sevag法去除当归粗多糖中的蛋白质

当归糖是一门从后方植物当归糖（oliv.）根提取的糖成分。这些糖含量约为原干燥药物的85%。它调节了生命力，影响了造粒系统，肿瘤和抗辐射。为确切了解当归多糖结构与功能的关系,先要获得提纯的多糖。去除多糖中的蛋白质是当归多糖精制过程中的重要一步。目前除多糖中蛋白质的常用方法有Sevag法、三氯醋酸法、蛋白酶法、透析法和732树脂法等。杨铁虹报道用反复冻融法除当归粗多糖中蛋白质效果较好,但未见详细报道。本研究通过单因素试验方法建立了Sevag法去除当归粗多糖中蛋白质的最佳条件,并与反复冻融法相比较,为大规模提纯当归多糖提供参考。1仪器、仪器和仪器当归多糖粗提取物(多糖含量75.8%)购于山东旺圣药业股份有限公司。无水乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇均为国产分析纯。离心机(AnkeTDL-40B,上海安亭科学仪器厂),紫外可见分光光度计(UV-mini1240,日本岛津公司),试管混匀器(SK-1天津华北实验仪器有限公司),分析天平(FA2004,上海精科天平有限公司),冷冻干燥机(FD-1A-50,北京博医康实验仪器有限公司),磁力搅拌器(HJ-4A,天津市华北实验仪器有限公司)。2方法2.1无水乙醇醇沉法当归粗多糖溶于水,4000r/min离心10min去除杂质,上清加2倍体积的无水乙醇醇沉。离心后沉淀用无水乙醇和丙酮反复洗涤至上清液无色,沉淀冻干后配成的多糖溶液备用2.2机械研磨法21,51,61和61氯仿与正丁醇体积比设以下5个梯度,即2∶1,3∶1,4∶1,5∶1和6∶1。Sevag试剂与当归粗多糖溶液按1∶3混合,搅拌30min后,4000r/min离心10min,取上层糖溶液测多糖和蛋白质含量。2.3监狱警察的职责分类多糖溶液与Sevag试剂的体积比分别为1∶1,2∶1,3∶1,4∶1和5∶1。搅拌30min后4000r/min离心10min,取上层糖溶液测多糖和蛋白质含量。2.4研究对象多糖溶液与Sevag试剂的搅拌时间分别设为10,15,20,25,30,35,40,45,50min。搅拌结束后4000r/min离心10min,测上层糖溶液中多糖和蛋白质含量。2.5冷冻溶液的制备将多糖溶液置-20℃冰箱冷冻后,室温溶解,4000r/min离心10min,再冷冻,再溶解。每次溶解、离心后测上层糖溶液中的多糖和蛋白质含量。2.6sevag法与反复冷冻法的除蛋白质作用的比较找出Sevag法除蛋白质的最适条件后,与反复冻融法比较,以确定除蛋白质的最佳方法和次数。2.7测量和指标2.7.1多糖损失率多糖含量用苯酚-硫酸法测定,用分析纯葡萄糖做标准曲线。多糖损失率(%)=100×(M1-M2)÷M1。M1:去除蛋白质前溶液中多糖的含量;M2:去除蛋白质后溶液中多糖的含量。2.7.2蛋白质去除率及蛋白前溶液蛋白含量的测定蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定,用牛血清白蛋白做标准曲线。蛋白质去除率(%)=100×(N1-N2)÷N1。N1:去除蛋白质前溶液中蛋白质的含量;N2:去除蛋白质后溶液中蛋白质的含量。2.8dunpan多重比较所得数据用SPSS16.0统计软件做单因素方差分析,差异显著的(P<0.05)用Duncan法做多重比较。表中数据用x±s表示,n=3。3结果3.1蛋白质去除率和多糖损失率不同比例的氯仿与正丁醇与多糖溶液混合后,搅拌30min,测得的蛋白质去除率和多糖损失率见表1。由表1得知,当氯仿与正丁醇比例为4∶1时,蛋白质去除率最高,多糖损失率最低。因此氯仿与正丁醇的最适比例为4∶1。3.2蛋白质去除率和多糖损失率的测定氯仿与正丁醇按4∶1配成的Sevag试剂与当归粗多糖溶液按不同比例混合,磁力搅拌器搅拌30min后,测蛋白质去除率和多糖损失率。结果见表结果表明粗多糖溶液与试剂按和混合,蛋白质去除率均较高且二者间差异不显著,但3∶1时的多糖损失率显著低于4∶1,因此粗多糖溶液与Sevag试剂的最适比例为3∶1。3.3混合过程中蛋白质去除率和多糖损失率的测定当归粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)按3∶1混合,搅拌不同时间后测蛋白质去除率和多糖损失率,结果见表3。搅拌时间在20～45min时蛋白质去除率均高于70%且差异不显著。多糖损失率随搅拌时间的延长而显著升高。因此搅拌时间为35min时最佳。3.4反复冻融法与sevag法不同处理次数下多糖去除率在Sevag法除蛋白质的最适条件下除蛋白质8次,与反复冻融法比较,结果见表4～5。由表4可以看出,除蛋白质5～8次时的蛋白质去除率较高且差异不显著,但多糖损失率随处理次数的增加而升高。因此Sevag法除蛋白质最适次数为6次。由表5可以看出除蛋白质3～8次时的蛋白质去除率相近且差异不显著,但多糖损失率差异显著。因此反复冻融法除蛋白质最适次数为4次。与Sevag法相比,反复冻融法除蛋白质虽然多糖损失率稍高,但蛋白质去除率更高,而且处理次数少。因此反复冻融法除当归粗多糖中蛋白质的效果优于Sevag法。4搅拌时间对粗多糖多糖去除率的影响影响Sevag法除蛋白质的因素主要有氯仿和正丁醇的体积比、样品溶液与Sevag试剂的体积比、搅拌时间等。Sevag试剂中氯仿和正丁醇的比例对蛋白质去除率和多糖损失率影响较大,需要选择合适的比例。本实验发现不同氯仿和正丁醇比例对蛋白质去除率和多糖损失率均有显著影响(表1)。样品溶液与Sevag试剂的比例也很重要。本实验发现,粗多糖溶液过多和过少均降低蛋白质去除率,多糖损失率随多糖溶液的增多而升高。在尽可能去除蛋白质的前提下,还需尽量缩短处理时间,因此选择适当的搅拌时间也很重要。本试验发现,搅拌时间过短和过长都会降低蛋白质去除率,多糖损失率随搅拌时间的延长而显著升高(P<0.05)。本实验通过对上述影响因子的研究,找出了Sevag法除当归粗多糖中蛋白质的最佳条件,即Sevag试剂中氯仿∶正丁醇=4∶1,当归粗多糖溶液(2mg/ml)与Sevag试剂的体积比为3∶1,搅拌时间为35min。通过比较Sevag法与反复冻融法的除蛋白质效果,发现反复冻融法优于Sevag法。虽然反复冻融法的多糖损失率稍高,但蛋白质去除率更高,处理次数少,而且反复