考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量摘要本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/LpH9.0Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/LEDTA和1%PVP)。前言果蔬可溶性蛋白质含量(solubleproteincontent)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。以比活力(unit/mgprotein)表示酶活力大小及酶制剂纯度时，可溶性蛋白的测定也是必不可少的。1实验部分1.1实验原理比活力(unit/mgprotein)表示酶活力大小及酶制剂纯度，同时采用考马斯亮蓝法测定蛋白质相结合，得到标准曲线。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该方法标本用量少、灵敏度高、重复性好，是一种较为理想的方法[7]。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值、料液比和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。1.2实验准备1.2.1实验材料新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。1.2.2仪器与设备容量瓶（25mL10个、100mL1个、500mL1个、棕色瓶1个、分析天平、胶头滴管、烧杯（50mL2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL1个、25mL1个）、研钵；UV-1800型紫外-可见光分光光度计日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。1.2.3试剂配制1.2.3.1标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL；1.2.3.2考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL90%乙醇中，加入50mL85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中；1.2.3.3提取液：pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)；1.2.3.4梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH9.0)：10、30、50、80、100mmol/L；1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V)。1.3实验步骤1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。1.3.2标准曲线的绘制取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程表1绘制标准曲线的各试剂添加量项目管号012345100μg/mL牛血清白蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.60.40.201.3.3果蔬组织可溶性蛋白质的提取1.3.3.1最佳缓冲溶液和pH值的确定称取苹果果肉样品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用[8]。1.3.3.2最佳提取缓冲液浓度的确定以3.3.1节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液[9]。提取体系及方法同3.1节。1.3.3.3适宜外源添加物的确定以3.3.2节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同3.1节[7-13]。（添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇）1.3.3.4苹果组织可溶性蛋白质含量的测定吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放