荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)

荧光技术韩东洺

细胞生物学科

2014-11-52015年6月15日1荧光和荧光素

利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)，用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位置。2常见荧光素：

（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein

isothiocyanate,

FITC)（2）四乙基罗丹明

(rhodamine,

RB200)（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl

rhodamine

isothiocynate,

TRITC)（4）镧系

（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）（6）多甲藻叶绿素蛋白

（peridinin

chlorophyll

protein，PerCP）（7）碘化丙啶（

propidium

iodide，PI）3合适荧光素的选择：

具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

荧光效率高，标记后下降不明显。

荧光色泽与背景色泽对比鲜明。

标记后能保持生物学活性和免疫活性。标记方法简单、快速。

安全无毒4荧光显微镜（fluorescencemicroscope）

荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。光源滤光片光路聚光器镜头图像采集系统

荧光光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯

滤色系统：激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范围，只有能激发荧光染料发光的特定波长的光通过。阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧光，呈现专一的荧光色彩。

透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。

透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)光路5荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片

载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

（二）盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。

（三）标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l

pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

（五）镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。6使用荧光显微镜的注意事项

（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。

（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节

省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间防止封裱剂蒸发。

（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。荧光分光光度计工作原理：

由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（emissionspectrum），简称荧光光谱。

7荧光分光光度计当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱（emissionspectrum）。

当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。荧光分光光度计原理图荧光分光光度计的基本结构是:光源单色器或滤光片样品池单色器或滤光片检测器注意事项：（1）

注意开机顺序。

（2）

注意关机顺序。

（3）

为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高压、狭缝的设置一般不宜选在高档。（4）

关机后必须半小时（等氙灯温度降下）方可重新开机。

8荧光技术的应用（1）免疫荧光技术用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(directimmunofluorescenttechnique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirectimmunofluorescenttechnique)”。抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。直接法荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。直接荧光抗体染色法示意图

间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图

染色程序分为二步，最终使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。抗补体染色法优点缺点直接法特异性高，操作简便，比较快速。一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。间接法既能检查未知抗原，也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。

由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。补体法即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。

（2）作为生物大分子筛选与鉴定的标记物

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有：

分子标记利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

烟草细胞标记的蛋白质进行细胞内的活体观察

药物筛选

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

（3）荧光原位杂交

原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。（4）无机分析在无机元素分析中,主要是通过待测元素与有机试剂(或荧光试剂)生成配合物或发生荧光猝灭效应来测定元素的含量。目前可以通过荧光分析测定70多种金属离子和阴离子,如Ag、Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、Hg、In、Ir、Li、Mg、Mn、Nb、Ni、Os、Pb、Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、Lu、Sm、Cd、Cr(Ⅵ)、Se、Te、Re等（5）有机物分析近年来有机物荧光分析研究在我国发展迅速,年文献量不断增加。主要应用领域有中西药和临床、食品营养和添加剂等试样。激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤,显微荧光法研究药物与细胞的相互作用,DNA编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。环境检测领域:荧光分光光度计检测技术已经成为环境污染监测中污染物定性和定量分析的有效手段。如不同类型不同场地的石油及其产品成份各有不同,其荧光光谱也有着显著的区别,利用油标可在激发310nm,发射365nm处测量淤泥和海水中油污样品中总油的含量。还可以对机油、柴油、重油、原油及液压油进行初步鉴定；空气尘埃中多环芳烃的检测。其他如阴离子表面活性剂作为洗涤剂污染的主要成份,叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素a和脱镁叶绿素b作为水环境浮游植物生物量和水体富营养化的重要指标以及多环芳烃等都可用荧光分光光度计测量。食品和药物成份分析领域：

曾用荧光法分析食品和药品中的化合物如：维生素A、维生