球虫DNA及RNA提取方法汇总

粪便中卵囊的收集和纯化简介球虫感染鸡后，在宿主体内经裂殖生殖、配子生殖后形成带有卵囊壁的未孢子化卵囊，随粪便排出体外。粪便中的卵囊由于密度小于饱和盐水，因而可以被后者漂浮起来；而卵囊的密度又大于稀释的盐水溶液，故而可以从稀释的盐水中沉淀下来。根据此原理，利用饱和盐水漂浮粪便中的卵囊，然后将含卵囊的饱和盐水用水稀释后离心沉淀，即可将卵囊从粪便中分离和纯化。材料塑料盆若十个（视所收集的粪便量而定）80目（60目、100目也可）和160目（或者180目）金属筛各一个搅拌用塑胶软铲一个不锈钢铲子一个1L塑料烧杯1-3个，100ml、500ml塑料烧杯各一个离心罐（低速大容量离心机因平衡需要，需在任何离心时将6个罐平衡后全部放到支架上）报纸若干张尖头吸管玻璃棒（粗）或药品勺（不锈钢制）吹气软管（以上物品需在烤箱中80°C烘烤2h后使用）秤（婴儿秤）一台电子天平（普通天平也可）一台吹气设备饱和盐水（自来水加入过量食盐煮沸，冷却后分装至塑料桶或500ml瓶中，注意防冬天温度过低造成盐水不饱和）2.5%重铭酸钾溶液步骤用塑料盆收集接种后6.5-8天的粪便（本时间选取是针对柔嫩艾美耳球虫的，其他虫种请查阅文献，确定收集时间），搅拌均匀（若鸡只数目少，应在6.5天时在粪便收集盘中洒一些重铭酸钾溶液以保持粪便湿润），称重；称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数；计算粪便的OPG（计数所的读数X200），估算粪便中卵囊总数；将粪便中加入5-10倍体积的自来水，搅拌均匀，然后用80目筛子进行过滤；此过程中需用塑胶软铲不停搅动，使大部分的水溶液滤过筛网，收集至一塑料盆；滤后的粪渣置于另一塑料盆；粪渣再加入自来水，如步骤3过滤；此过程重复2次（针对粪便量少者，可以增加一次以提高卵囊收集率），最后弃去粪渣；将所有的滤过液用160目的筛子进行二次过滤，滤液收集至塑料盆中；滤液静止3h或更长（不宜过夜，长时间浸泡对卵囊活力有影响；需过夜再继续操作者，应在滤液中添加重铭酸钾，至浓度在1-2.5%），然后快速倾去大部分上清（动作既快又稳，小心不得将沉淀倒掉）；将所得到的混悬液离心（3000rpm，8T0min或3600rpm，5min；以下离心均采用此设置），收集所有沉淀；用玻棒搅匀沉淀，加入少许饱和盐水，搅匀，再次添加并搅拌，全形成均匀的混悬液（一般加入的饱和盐水的体积为粪便沉淀的5倍，采用步骤10（2）时可以将加至离心罐容积上限）；离心漂浮卵囊；（后续的操作步骤10有两种，粪便沉淀量少者可采用第一种10（1），量大者可采取第二种10（2））（1）所得的含卵囊上清倒入一个大烧杯中，重复步骤8，离心后同样将上清收集至烧杯；并再重复一次，合并3次所得上清；将上清均匀分配至离心罐中，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；（2）用尖头吸管吸取上清表层漂浮的卵囊，所吸液体收集于一个烧杯中；全表层大部分卵囊漂浮物被吸走后，将剩余上清转移至另一大烧杯;沉淀搅匀后，倒回转移的饱和盐水，少量多次并搅拌，同步骤8,可补加盐水以弥补上清吸取转移走的盐水；如此再重复2次，合并3次所吸取的表层卵囊溶液，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；所得卵囊沉淀因含有大量粪便等杂质，需再次用饱和盐水离心漂浮一次（若卵囊数量少于1千万，此步骤推荐用50ml离心管进行操作，以免丢失过多）；随后离心沉淀；两次漂浮沉淀后得到的卵囊沉淀用重铭酸钾溶液重悬，转移至小锥形瓶或盐水瓶中（重铭酸钾的体积根据卵囊的数量决定，每毫升所含卵囊不得超过100万，但可以多加）；接好吹气装置，置于28^温箱或自制孵化箱中通气孢子化，时间为48小时（注意24h时添加水，补偿吹气孵化所蒸发的水）；孢子化完毕，将卵囊做好标记保存于4°C；做好善后事宜，如操作台和离心机的清洁、所用物品的清洁与归位、鸡只的剖杀与笼具的清洗等。（刘贤勇整理）球虫基因组从田间样品中的提取1、试剂卵囊裂解缓冲液：20mM（毫摩每升）Tris-HCI,pH8.0；100mMEDTAand1%SDS0.5MEDTA（pH8.0）：在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L，高压灭菌。1MTris-HCl：将121.1gTris碱溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值至8.0（约需42ml浓盐酸），定容至1000ml，高压灭菌。10%SDS：量取电泳级SDS100g（戴口罩操作）溶于900ml蒸馏水中，加热至68°C助溶，用HCl调pH值至7.2,加水定容至1000ml。蛋白酶K溶液（20mM）:德国默克公司80%异丙醇溶液2、操作步骤1、 取106个已纯化卵囊，在1.5ml的离心管（需用进口管）中4000转离心5分钟，弃上清。2、 加入等体积425-600〃m玻璃珠，置于旋涡震荡器上，3000rpm/min震荡，直到90%以上的卵囊破碎（~15min）。3、 取360M卵囊裂解缓冲液和40闫蛋白酶K溶液加入离心管中，置37C摇床中孵化48小时。4、 12000rpm/min离心1min，取上清入新管。5、 加入1ml清洗树脂（按50-500M悬液/1ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀6、 取一支2ml或者5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上WiardTM微型柱，将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中。7、 用注射器内芯推液筒，慢慢的将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。8、 将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2ml柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。9、 拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，以除去残留的异丙醇。10、 将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入30-50闫预热（60-70C）的超纯水或1XTE缓冲液，静置1min，10000rpm离心20sec。离心管中的液体即为DNA溶液。11、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定球虫基因组DNA提取结果。（孙希萌整理）大量球虫卵囊基因组DNA的提取（CTAB法）试剂2xCTABbuffer:药品或储液用终浓1MTris-HCl(pH7.5or8.0)10100mMCTAB2g2%5MNaCl28m1.4M0.5MEDTA(pH7.5or8.0)420mM亚硫酸氢钠11%ddHOto100ml2注：配制时，现将CTAB溶于水，再加入其它药品和试剂RNase：储液：10mg/ml（配制方法：取0.5gRNaseA置于50ml塑料离心管中；加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容50ml；100°C煮沸15min,缓慢冷却全室温，1ml/管小份分装后，置于一20C保存）；使用时：每1mlddHO中加2入8ulRNAse储液；酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）；氯仿:异戊醇（24:1）；异丙醇；70%乙醇。仪器设备高速冷冻离心机；EP管（酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异戊醇抽提时，一定要用聚丙烯管，不可用聚碳酸酯管）；玻璃研磨器（使用前煮沸5min以上或高压灭菌）；实验操作步骤卵囊离心，洗去储存液，并用NaClO消化（一定要在提取之前消化，以除去其它微生物的基因组污染）;用无菌蒸馏水按体积比1:1重悬卵囊，加入研磨器中；置冰上研磨，直至卵囊释出内容物；按体积比1:1的用量，用2xCTAB溶液洗下所有研磨物，转移至EP管，每管装600ul；置60°C水浴，孵育30min；加入600ul酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡10s，14000rpm离心3min；取上清入新管（剩有有机层和杂质的管，要扣紧管盖后再丢弃，以防污染环境）；注：若杂蛋白较多，可再重复步骤6和步骤71-2次。加入600ul氯仿:异戊醇（24:1），震荡10s，14000rpm离心3min；取上清入新管；加入等体积异丙醇，颠倒混匀，直至析出沉淀（-20C放置、或过夜沉淀，有助增加沉淀的量）；11.14000rpm离心10min，收集沉淀；用70%乙醇洗沉淀，14000rpm离心3min，弃上清；用微量真空泵小心吸去残液，37C或室温晾十；用含RNase的ddHQ或TEbuffer溶解沉淀，并于37C温箱作用1h以上、2或4C过夜，消化RNA，最后S-20C保存（要长期保存，则无需加水溶解，直接将固体沉淀置-20C或-80C冰箱冻存即可）。注：提取结束后，建议跑胶，检测DNA的完整性，并估算DNA浓度。球虫子抱子总RNA，基因组DNA和蛋白质的

提取方法一、球虫子抱子总RNA的提取（一）试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水（溶液均需用DEPC处理过的水配制）（二） 仪器及耗材的处理：（三） 操作步骤：取约1X107个子孢子（必须是新鲜提取的）悬液，2000rpm离心5min加入1mlTRIzol，用移液器反复吸打几次，直至子孢子完全裂解，室温（15-30°C）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；每ImlTRIzol中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；8C不超过12000Xg离心、15min。5.将水相转移到新管中（如需分离DNA和蛋白质，可保留有机相，操作步骤见后面），用预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA；每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min；8C不超过12000Xg离心、10min，弃上清。用75%乙醇洗涤RNA沉淀；每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇°2-8C不超过7500Xg离心5min，弃上清。用移液器吸弃残留乙醇，根据RNA的量加入25-100〃l无RNase的水，用枪头吸打几次使RNA溶解。注意事项：所用的耗材尽量用一次性的进口耗材，保证没有RNA酶污染；在操作过程中要戴手套和口罩，确保不要带入外源性的RNA酶；提取的RNA要保存于-70°C。二、球虫子弛子DNA的分离（一） 试剂：乙醇，0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇），75%乙醇，TE缓冲液。（二） 操作步骤：样品加氯仿分层后,移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8C不超过2000Xg离心5min；移去上清（如需分离蛋白质，可保留上清，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用ImlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30min，2-8°C2000Xg离心5min，弃上清，重复一次；用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用ImlTRIzol加入1.5-2ml75%乙醇，室温放置10-20min（不时颠倒混合），2-8C2000Xg离心5min,弃上清；室温放置晾十DNA5-15min，用TE缓冲液溶解DNA。注意事项：DNA在中间层和有机相中时可在2-8C保存过夜；DNA沉淀在75%乙醇中2-8C可保存几个月；DNA在8mMNaOH溶液中4C可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4C或-20C长期保存。三、子抱子蛋白质的提取（一） 试剂：异丙醇，含0.3M盐酸胍的95%乙醇，无水乙醇，1%SDS（二） 操作步骤：取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8C12000Xg离心10min弃上清。用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20min，2-8C7500Xg离心5min，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。真空抽十蛋白质沉淀5-10min，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50C