影响麻疹igm抗体检测的因素分析

影响麻疹igm抗体检测的因素分析

为了认真落实卫生部《2006-2012年全国消除癫痫计划》，在控制和消除癫痫发作的过程中，不仅要有效地接种流动人口的疫苗，还要准确、及时地检测皮疹。酶联免疫吸附实验(ELISA)一步法检测麻疹IgM抗体具有灵敏度高、特异性强等优点而被广泛应用。为了保证麻疹在实验室检测中的稳定性、准确性,我们不断实践,反复验证,现就实际工作中发现的一些影响因素进行探讨。1材料和方法1.1材料表面对疑似、确诊的麻疹病例进行血液采集,对分离后的血清进行检测。血清样本使用统一试剂盒,进行酶联免疫吸附实验(ELISA法)。1.2血清样品由一个单一的测试盒制成，用于酶联免疫吸附试验elisa法1.2.1微板孔温度的测定先从冰箱中拿出试剂盒,在室温下放置20~30min后进行测定,可使试剂盒在使用前与室温平衡,这样反应微板孔内的温度能较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求。1.2.2样品选择1.2.2.igm抗体稳定性测定使用ELISA方法检测麻疹IgM抗体,我们一般选用出疹后4~28天的首份血样。1.2.2.2血液标本的使用(1)尽量低温保存,防止污染;(2)避免样本溶血;(3)严禁反复冻融,以免对IgM抗体的稳定性产生不利影响;(4)实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差;(5)加酶试剂后,用吸水纸吸干孔外试剂;(6)作定量试验时,使用加样器加注试剂,并经常校正其准确性。1.2.2.存时限不同血清在运输之前应置于4~8℃保存,保存时限不能超过7天。如果需要保存更长的时间应置于-20℃或更低的温度冷冻保存。运输过程要放置冰袋,严禁上下颠倒。1.2.3出现在模型试验中,各部门对结果准确性比将液体及标本加在孔底,不外溅,避免加在孔壁上部,以免影响结果的准确性。加样头的尖端要避免在孔底挂擦,一次性使用加样头,禁止在未充分洗净或消毒不完全时使用,以免交叉感染而使结果不准确。1.2.4微孔板温度测定中的问题根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和(或)试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果是将微孔板一放入温箱即开始计时,这样就容易造成实际测定中温育时间不够,易致弱阳性标本无法测出。1.3洗不生洗液污染每次温育结束后要仔细在每孔加,手工洗板时,入洗液300µl,谨防洗液溢出污染,同时避免洗液量不足造成洗不干净。洗板间隔按照试剂使用要求停留足够的时间。洗板流程全部结束后,再进行拍板干燥板孔,严禁洗板中间过程中拍板。进行机洗时,应注意观察是否有洗液外溢等污染板孔的现象。拍板干燥工作也在洗完的最后进行。1.4按照顺序添加“a”溶液和“b”溶液，混合，放入37水浴，冷却反应30分钟，并停止溶液的观察结果1.5观察结果肉眼观察阳性结果呈蓝色,但弱阳性结果不易观察。应使用多功能酶标仪检测,以保证结果判断的正确性。2假阴性产生的原因在大量的日常工作中,ELISA实验的质量保证是一个复杂的过程,许多重要的环节都影响到检测的质量,在实际操作中会我们通常会遇到以下一些问题:(1)假阳性的出现;(2)复检与初检结果不一致;(3)假阴性的产生导致的漏检。我们通过大量的临床实验发现,以下几个步骤中较易出现对实验结果产生影响:2.1试剂的准备对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。而样本中含有的类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF),其一般为IgM型,亦有IgG和IgA型,具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果。2.2记录血液样品的采集在出疹后的前3天内,麻疹特异IgM抗体可能会出现30%的假阴性结果。因此在工作中要仔细记录血液样品的采集时间,以备实验中查找可疑因素。在采血时应注意手法,采集的血液勿用力振荡,严防标本溶血。2.3冻融法分离标本成功率高标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性,因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色。冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果。因此,ELI-SA检测尽量采用新鲜标本,标本凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性。溶血标本易使麻疹IgM抗体产生假阳性结果,可能是因为溶血标本有过氧化物酶活性,与辣根过氧化物酶作用相似,能与聚乙烯孔内预包被的抗体结合,由于难于完全洗脱,残留过氧化物催化底物显色,产生假阳性。2.4滴瓶滴加试剂量不确定在加样过程中,加样时间过长,酶试剂加出孔外,使用滴瓶滴加试剂时,滴加的角度不同和挤压的力度不同,致使滴加的试剂量不准,都可导致试验结果不准确。2.5elisa检测表现酶联免疫法加入酶标物37℃温育30min对测定结果有影响,易产生弱阳性造成误检。加入酶标物37℃温育60min,温育时间长,残留的过氧化物酶含量极微,再经洗涤降低了残留的可能性,虽然费时,但与37℃温育30min相比,灵敏度更高、特异性更强,能保证结果的准确性。因此,在实际操作中采用37℃温育60min。此外,我们还应在实验中注意“边缘效应”,其产生的原因可能是因为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴。慎重选择试剂盒和内部质控血清检测值做质控图,能让我们很容易监测ELISA实验的一致性,从而尽早发现实际工作中的问题,避免在实际工作中的一些客观影响因素。随着科技在各个领域的飞速发展,麻疹病毒的检测方法也在不断地更新,酶联免疫吸附法检测麻疹IgM抗体作为诊断麻疹的重要方法,目前已被广泛应用。在长期大量的工作实践中,我们发现不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致,即使是通过批检的试剂其检测结果也存在差异,因此必须选择和订购长批号的试剂,并按保存条件存放。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质量控制体系及重新评估试剂的复杂过程,并且能够保证结果的稳定性;对于效期短、使用率低的试剂,应当小量分装,每次使用则取分装部分即可,避免反复冻融造成试剂的失效。在实际的工作中我们也认识到,除了要提高操作技术水平外,还有必要对常用试剂的性能进行比较考察,从而选择灵敏度和特异性相对较高的试剂盒。同时,我们按一定的时间间隔在实验中加入一些按照部、