高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定海洋藻类色素

高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定海洋藻类色素

浮游生物是海洋的主要制造商。它在物质交换、能量转化、海洋食品网络结构等基础环节中发挥着重要作用。浮游藻类色素已被证实为浮游植物分类的重要化学分类标志物,并被应用于传统显微镜镜检难以确定的微型浮游藻和由于过滤损失或预处理易被破坏的微藻种类鉴别中。浮游藻类色素主要分为3类:叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白,其中叶绿素a普遍存在于所有藻类细胞中并被广泛用作测定生物量的标志物,叶绿素b和叶黄素被认为是绿藻的特征色素,β,β-胡萝卜素广泛存在于海洋浮游藻类中,岩藻黄素被认为是硅藻的特征色素;这5种色素对海洋藻类生物量研究具有重要意义。如今,采用高效液相色谱(HPLC)分析色素的方法已广泛应用于调查研究海洋藻类组成和浮游藻类群生物量,一次运行可分离超过50种色素且具有较好的分离度,实现了自动快速对样品进行定性定量分析。HPLC分析浮游藻类色素的方法已被应用于确定浮游藻种类、评估自然水体中浮游藻生物量和生物多样性等。现已发展多种用于HPLC分离的色谱柱:C8色谱柱、C18色谱柱、C30色谱柱和C16氨基色谱柱。C18色谱柱对极性叶绿素和二乙烯基叶绿素的分离效果不好,C30色谱柱常被用于食品色素分析而在浮游藻类色素分析上有局限性。2011年,Jayaraman等首次使用反相C16氨基色谱柱。C16氨基色谱柱最初是为药物制备纯化和分析而设计,以其酰胺官能团特有的性质使得C16氨基色谱柱在承受高比例含水流动相、分离物质极性范围、洗脱能力等方面优于C8色谱柱和C18色谱柱。自然界中色素种类繁多、化学结构相似、极性差别大等给HPLC分离带来了难度。HPLC-MS技术可以为这类结构类似物提供更多、更有价值的色谱与电子光谱数据;该技术可以通过色素质荷比的不同和特征离子的差异进行分离和判定目标物质。HPLC-MS技术越来越广泛地应用于海洋光合色素分析中。其中,高效液相色谱-三重四极杆质谱联用(HPLC-QqQ-MS)系统以其定量精确性成为色素分析的新手段。色素中存在大量的同分异构体,比如原脱植基叶绿素与甲基脱植基叶绿素,海胆酮、隐藻黄素与蓝藻黄素,角黄素与别藻黄素,β,β-胡萝卜素、β,ε-胡萝卜素、ε,ε-胡萝卜素与β,ψ-胡萝卜素等。LC-MS定量分析过程中,由于色谱分离原因,一个色谱峰中可能含有几种不同的组分,即保留时间相同、相对分子质量也相同的同分异构体,使得这类物质的精确定量受到影响。为了消除干扰,串联质谱的选择反应监测(SRM)模式是最佳选择,SRM模式以组分相对应的特征碎片离子作为定量离子,有效消除了干扰组分的影响,从而使得定量更加精确。本文利用HPLC-QqQ-MS的SRM模式建立了5种色素叶绿素a、叶绿素b、β,β-胡萝卜素、叶黄素和岩藻黄素的定量分析方法,并利用该方法比较了赤潮异弯藻、卡罗藻、微小原甲藻、微拟球藻、蛋白核小球藻、颗石藻、定鞭金藻、中肋骨条藻、威氏海链藻和假微型海链藻之间物种色素的分布情况。1实验部分1.1超纯水系统试剂TSQQuantumAccess液相色谱-三重四极杆质谱联用系统(美国ThermoFisherScientific公司),超纯水系统(法国Millipore公司)。叶绿素a(纯度>95%)、叶绿素b(纯度>90%)、β,β-胡萝卜素(纯度>95%)、叶黄素(纯度>75%)、岩藻黄素(纯度>95%)、甲醇和乙腈(HPLC级,美国Sigma-Aldrich公司),丙酮(HPLC级,国药集团化学试剂有限公司),乙酸铵(HPLC级,美国TEDIA公司)。其他试剂均为国产分析纯。1.2单标准储备液v/v准确称取叶绿素a、叶绿素b、β,β-胡萝卜素、叶黄素和岩藻黄素各1.0mg,分别用丙酮、90%(v/v)丙酮水溶液、氯仿、丙酮和乙醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,均配制成0.1g/L的单标准储备液,置于-80℃冰箱中保存。制作工作曲线时,用甲醇将储备液稀释成不同浓度的标准溶液。1.3藻种和藻种藻种由浙江省海洋生物工程重点实验室微藻种质库提供,分离自浙江沿海和胶州湾。选用藻种有甲藻、绿藻、针胞藻、定鞭藻和硅藻。甲藻:卡罗藻(Karlodiniumveneficum)(NMBjah047-1)和微小原甲藻(Prorocentrumminimum)(NMBjah042);绿藻:微拟球藻(Nannochloropsisoceanic)(NMBluh014)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)(NMBluh015-1);针胞藻:赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)(NMBRah03-2)和赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)(NMBRah03-2-2);定鞭藻:颗石藻(Pleurochrysissp.)(NMBjih026-1)和定鞭金藻(Prymnesiumsp.)(NMBjih029);硅藻:中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)(NMBguh004-1)、威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)(NMBguh021)和假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)(NMBguh005)。藻种培养在F/2培养基中,置于光暗周期比为12h∶12h的光照培养箱内,光照强度范围为40~70μmolquanta/(m2·s),生长温度为20℃。藻种在指数生长期末尾收获约100mL藻种培养液,在弱真空(<0.03MPa)和微光下过滤到0.22μmWhatmanGF/F玻璃纤维滤膜上。滤膜用锡箔纸包裹保存在-80℃下冷冻保存。冷冻的滤膜需在一个月内进行色素提取和分析。1.4玻璃质量的提取将冷冻的滤膜快速解冻后剪碎放入10mL具塞棕色玻璃试管中,加入2.7mL冷丙酮后在冰水浴中超声2min,再加入0.3mL的超纯水,使丙酮最终含量为90%,将超声后的玻璃试管放在-20℃冰箱中静置过夜提取。上机检测前先于12000r/min下离心10min,取上清液再用聚四氟乙烯(PTFE)滤膜针筒过滤器过滤,去除杂质和细胞碎片。检测时在300μL的检测样品中加入300μL0.5mol/L乙酸铵溶液以提高分离度和改善峰形。所有操作均在暗室中的冰盒内进行。处理后的样品必须在48h内上机检测以降低色素降解对结果的影响。1.5检测系统及流程色素提取物通过TSQQuantumAccess高效液相色谱系统分离。使用SupelcoDiscoveryC16氨基色谱柱(150mm×4.6mm,粒径5μm,孔径18nm),进样量为10μL,柱温为30℃;流动相为甲醇(A)、乙腈(B)和0.5mol/L乙酸铵溶液(C),流速为1.0mL/min,按1∶4的分流比进入离子源。线性梯度洗脱程序:0min,80%A,20%C;7min,72%B,20%C;11min,77%B,18%C;19min,85%B,2%C;30min,80%B,20%A;34min,60%B,40%A;36min,80%A,20%C,保持4min;洗脱总时间为40min。样品室温度设定为4℃,二极管阵列检测器(FINNIGANSURVEYORPDAPlus)的检测波长为350~750nm。采用电喷雾电离源(ESI)正离子电离模式,喷雾电压2.5kV,鞘气流量25L/min,辅助气流量5L/min,离子传输毛细管温度320℃,喷雾器温度300℃。扫描采用SRM模式。特征碎片离子及碰撞能量见表1。采集时间均为0.2s,碰撞气体采用高纯氩气,碰撞气压力0.2Pa。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7Da。2结果与讨论2.1srm-过滤法以流动注射方式对1ng/L的5种色素标准溶液进行ESI-MS分析,分别在正、负离子模式下检测。对比两种模式,各目标物的正离子信号比负离子信号强度高1~3个数量级,因此选择正离子模式作为质谱采集模式。在正离子模式下离子峰的信号最强,叶绿素a、叶绿素b和岩藻黄素产生的[M+H]+分别为m/z893.6、907.6和m/z659.3;β,β-胡萝卜素和叶黄素产生的[M]+分别为m/z536.3和m/z568.4。故选择各目标化合物的[M+H]+或[M]+作为SRM模式的母离子进行二级质谱扫描,叶绿素a的母离子在二级质谱中脱去二十碳烯链形成[M+H-C20H40]+离子峰,再脱去一个乙酸形成[M+H-C20H40-CH3COOH]+离子峰,其二级碎裂如图1a所示,主要产生碎片离子m/z615.3和m/z555.2。叶绿素b在二级质谱中的裂解规律与叶绿素a相同(因为两者在结构上差异小,叶绿素b的侧链上为-CHO,叶绿素a为-CH3),其二级碎裂如图1b所示,主要产生碎片离子m/z628.8和m/z569.3。β,β-胡萝卜素的母离子在二级质谱中脱去一个甲苯形成[M-C7H8]+离子峰,再脱去一个甲基形成[M-C7H8-CH3]+离子峰,其二级碎裂如图1c,主要产生碎片离子m/z444.3和m/z429.1。叶黄素的母离子在二级质谱中脱去一个甲苯形成[M-C7H8]+离子峰,再脱去一个β-环形成[M-C7H8-C9H13O]+离子峰,其二级碎裂如图1d,主要产生碎片离子m/z476.3和m/z338.1。岩藻黄素的母离子在二级质谱中脱去一分子水形成[M+H-H2O]+离子峰,再脱去一分子水和一个乙酸形成[M+H-2H2O-CH3COOH]+离子峰,其二级碎裂如图1e,主要产生碎片离子m/z641.1和m/z567.1。选择上述母离子和主要碎片离子作为定量离子,以SRM正离子模式优化锥孔电压(tubelensoffset)、碰撞能量(collisionenergy)等质谱参数。5种色素标准溶液的SRM离子流图如图2所示。2.2方法验证2.2.1标准曲线、检出限和定量限用标准储备液分别精确配制含叶绿素a、叶绿素b、β,β-胡萝卜素和叶黄素为10、50、100、500和1000μg/L,岩藻黄素为100、150、200、500和1000μg/L的混合标准溶液。采用1.5节的条件进行HPLC-MS分析。结果显示5种色素标准品在其线性范围内的相关系数r2>0.996,其标准曲线如表2所示。各取10μL1μg/L叶绿素a、1μg/L叶绿素b、1μg/Lβ,β-胡萝卜素、1μg/L叶黄素和10μg/L岩藻黄素标准溶液进行分析,测定此浓度下的信噪比(S/N)。将对应S/N=10和S/N=3的各标准溶液浓度分别作为定量限(LOQ)和检出限(LOD),结果如表2所示。方法的LOD均不高于0.16μg/L,LOQ在0.06~0.54μg/L之间。而HPLC方法的检出限和定量限分别在1.05~12.70μg/L和3.14~38.11μg/L之间,表明本方法检测色素的灵敏度很高。2.2.2方法的精密度实验取低、中、高3个浓度的混合标准溶液进行测定,计算方法的精密度。在一天内连续进样测定5次,记录5种色素的峰面积及保留时间,分别计算各色素的保留时间和峰面积的精密度,各色素的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)见表3。由此可见,保留时间的日内RSD为0.07%~0.41%,峰面积的日内RSD为0.42%~4.20%;连续5天每天连续进样测定5次,记录5种色素的峰面积及保留时间,分别计算各色素的保留时间和峰面积的日间精密度,各色素保留时间和峰面积的日间RSD见表3。由此可见,保留时间的日间RSD为0.04%~0.40%,峰面积的日间RSD为0.57%~4.30%。实验结果表明本方法的精密度良好。通过空白添加实验方法测定方法的回收率。以空白滤膜为样品,分别添加低、中、高3个水平的标准溶液进行加标回收实验,每个加标水平平行测定3次,结果见表3。由此可见5种色素的加标回收率均在82%以上,RSD低于8%。该方法较好地满足了藻类样品中色素含量的测定要求。2.3藻种的检测结果藻种收获时先用显微镜进行细胞计数,分别取100mL赤潮异弯藻(NMBRah03-2)、赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)、卡罗藻(NMBjah047-1)、微小原甲藻(NMBjah042)、微拟球藻(NMBluh014)、蛋白核小球藻(NMBluh015-1)、颗石藻(NMBjih026-1)、定鞭金藻(NMBjih029)、中肋骨条藻(NMBguh004-1)、威氏海链藻(NMBguh021)和假微型海链藻(NMBguh005),测定藻的密度分别为2.75×105、8.25×104、7.75×104、8.25×104、1.75×105、6.76×104、2.00×105、7.25×105、2.18×106、3.95×104和1.40×106cell/mL。然后按照所建立的方法对每个藻种进行处理,每个样品平行上机检测3次。线性方程计算结果显示:叶绿素a和β,β-胡萝卜素存在于所有检测的藻种中,其中叶绿素a含量在颗石藻(NMBjih026-1)中最高(6.19×10-3ng/cell),在赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)中最低(4.42×10-5ng/cell);β,β-胡萝卜素含量在赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)中最高(6.65×10-4ng/cell),在微拟球藻(NMBluh014)中最低(1.75×10-5ng/cell);叶绿素b仅在微拟球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中检测到,含量分别为1.46×10-5和7.85×10-6ng/cell;叶黄素仅在微拟球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中检测到,含量分别为1.53×10-6和1.21×10-6ng/cell;岩藻黄素在赤潮异弯藻(NMBRah03-2)