海洋底栖硅藻温度生长条件及其主要理化组成研究

海洋底栖硅藻温度生长条件及其主要理化组成研究

海洋底藻是许多海洋动物育种过程中的重要饲料。底藻不仅能诱导鱼幼虫的附着，还能将细胞外生物作为重要食物从幼鲍的后期生长到800m。由于它们的品质优良，直接影响到种植区的成活率。因此，培育足够数量的优质底藻成为人工育苗中最重要的环节之一。国内外许多科学家主要进行了大量的浮游生物饲料研究，但关于仅在当地产生的浮游生物饲料的研究很少。温度不但影响底栖硅藻的生长和光合作用,而且影响胞内理化成分的合成和积累.硅藻胞内理化成分是影响幼鲍生长和变态的重要营养因子,关于温度对底栖硅藻胞内、外理化成分影响的研究甚少.温度亦是影响名贵水产经济动物生长的重要因素,分析底栖硅藻理化成分随温度的变化规律,并结合水产育苗的实际条件,对底栖硅藻饵料的规模培养和优质饵料的获得都具有重要指导意义和应用价值.作者从大连近海筛选到8种底栖硅藻,并研究了其作为水产动物幼体的附着变态及初期生长的饵料试验,获得了良好的效果.本文对该8种底栖硅藻的温度生长条件及其主要理化组成进行了研究,为其作为单一底栖硅藻饵料的规模培养及应用提供理论数据.1材料和方法1.1藻体的种类外科5e实验所用8种海洋底栖硅藻均为本验室从大连近海岸筛选到的藻种.分别是为双菱缝舟藻(Rhaphoneissurirella)、半裸舟形藻(Naviculaseminulum)、双尖菱板藻细头变种(Hantzschiaamphioxysvar.leptocephala)、易变双眉藻眼状变种(Amphoraproteusvar.oculata)、盔形舟形藻(Naviculacorymbosa)、菱形藻(Nitzschiasp.)、小形舟形藻(Naviculaparva)和咖啡双眉藻(Amphoracoffeaeformis).1.2藻种的活化培养和测定温度设定5±0.5、10±0.5、15±0.5、20±0.5、25±0.5、30±0.5℃6个梯度.采用添加硅酸钠的f/2培养基(Na2SiO3浓度为50mg/L),海水经抽滤(0.22μm)2次后,再高压灭菌20min.藻种活化后接种于300mL三角烧瓶内,接种密度为5×104mL-1,培养体积150mL,pH为8.5±0.1,光照强度为2000±200lx,光暗周期为12h∶12h,设3个平行,在ZPG-28型全自动光照培养箱中培养.1.3测量1.3.1比生长速率计算每天摇匀硅藻,从3个不同位置随机吸取藻液,超声波分散细胞后于显微镜下计数.计算比生长速率K:K=2.303×(lgN2-lgN1)/(T2-T1).式中:N2为指数末期细胞个数,N1为指数初期细胞个数;T2为指数末期时间,T1为指数初期时间.1.3.2差量法提取硅取藻液15mL,经0.22μm滤膜真空抽滤后用甲酸氨溶液(0.5mol/L)洗盐2次,于105℃下烘5h,在干燥器冷却到室温后称取质量(0.22μm滤膜提前在105℃下烘5h做预处理),用差量法得到硅藻干重.1.3.3蛋白质和胞内多糖含量的测定取3份15mL藻液,经0.22μm滤膜抽滤后去滤液,一份采用丙酮法测定叶绿素;一份加入5mLPBS缓冲液,30min内反复冻融3次,超声波清洗机处理20min后再离心,取1mL上清液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量,取1mL上清液采用蒽酮-硫酸法测定胞内多糖含量;另一份采用索氏抽提法测定总脂肪.取1mL滤液采用蒽酮-硫酸法测定胞外多糖含量.2藻体生长速率由表1可以看出,8种底栖硅藻在5~30℃都可生存,适宜生长温度范围根据藻种的不同而不同,在15~25℃之间比生长速率可达到最大.但在低温下(≤10℃)生长速度缓慢,而在30℃高温下开始抑制细胞的生长.其中双菱缝舟藻和盔形舟形藻在20~25℃,易变双眉藻眼状变种、小形舟形藻和咖啡双眉藻在20~25℃,半裸舟形藻、双尖菱板藻细头变种和菱形藻在25℃时,比生长速率可达到最大.不同种类硅藻的比生长速率相差较大,最小的是易变双眉藻眼状变种,最大的是小形舟形藻,两者相差1倍左右.高倍物镜下观测细胞形态:低温下细胞色素体颜色较深,细胞形态较小,培养基较清澈;高温下,细胞较大,细胞间凝聚性及附着能力都很差,色素体颜色变浅,试验结束时部分细胞或者形成苍白色的质体,或者细胞质萎缩,培养基中释放的杂质明显增多,比较混浊.由图1可以看出,胞内蛋白含量(图1A)、叶绿素含量(图1B)、总脂肪含量(图1C),胞内多糖含量(图1D)及胞外多糖含量(图1E)均随温度变化均呈现低-高-低的变化趋势,在接近最适温度可达最大值.低温下细胞生长缓慢,不利于各物质的积累,而30℃高温下物质含量几乎不增加甚至急剧下降.除了总脂肪含量在低于最适生长温度时达到最高以外,其他胞内理化成分在15~25℃之间接近最大比生长速率时均可达到最大值,但不同种属的硅藻之间相差很大,菱形藻和盔形舟形藻等密度较高的藻种胞内理化成分(叶绿素、蛋白和多糖等)都相当高,而双尖菱板藻细头变种和易变双眉藻眼状变种等低密度藻种理化成分含量却相对较低.不同硅藻的胞内蛋白含量最大相差约4.0%,多糖含量最大相差约14.0%,叶绿素含量最大差值可达6.0mg/L,总脂肪含量最大约为8.0%,胞外多糖浓度含量最大差约15mg/L.3不同培养温度对藻群多糖含量的影响硅藻多在营养盐不受限制及光强和光照时间适宜的冬春季节生长繁殖.温度对海洋微藻的生长和发育有调节作用,对酶的活性、营养物的吸收利用效率及细胞分裂的周期等诸多方面都存在不同程度的影响.微藻对温度的耐受能力因种类不同而存在很大的差异,因而各种藻类对温度的要求不同,有其各自的适温范围.对于光合自养生物而言,当超出适宜温度范围时,温度可能主要是通过控制物质与能量代谢过程中的酶的动力学来影响其生长.郭峰等培养的亚历山大菱形藻和矮小卵形藻卵等底栖硅藻,随温度的升高而生长显著加快,并在30℃时达到最高的生长速率;三角褐指藻等游浮硅藻的最适温度也在20~25℃.高温或低温都会影响微藻体内合成蛋白和多糖酶的活性,只有合成酶在最适的条件下,产量才能达到最大.张欣华等在培养4种海洋微藻时发现高温或低温都会使藻群受到严重伤害,小球藻和叉鞭金藻在培养温度15℃时胞内多糖含量最高,新月菱形藻和盐藻在25℃时多糖含量最高;李文权等应用14C示踪法测定了环境因子对4种海洋单细胞生化成分的影响,在最适温度下,4种单细胞藻脂类、碳水化合物和蛋白含量均有最大值,而且变化最显著.本研究的8种硅藻虽然不同种属,但在温度影响下生化变化规律表现了一定的相似性,在接近最适温度下含量可达到最大,可能是大部分单细胞海洋微藻的机制十分相似.细胞分泌的胞外多糖和胞内多糖有一定的关系.郑怡等发现培养9d后极大螺旋藻的胞内和胞外多糖含量都比培养3d和6d的含量有明显增加.胞外多糖可能主要在细胞生长过程释放出来的,随种类不同而异.一般在生长指数末期,胞内多糖积累到一定量,逐渐释放到培养基里.胞外多糖和细胞的生长可能有密切的关系,胞外多糖释放的越多,越有利于细胞间粘合在一起,从而有利于细胞的附壁生长,因而胞外多糖含量在最适温度能达到最大值.温度是影响微藻脂肪含量和脂肪酸种类的重要因子之一,多数情况下,适当提高温度,脂肪酸含量增加,多不饱和脂肪酸含量会减少.樊云真等对球等鞭金藻的研究结果表明,随着培养温度升高,其总脂含量及DHA占总肪酸的比例呈下降趋势.周洪琪等发现新月菱形藻的总脂肪含量与培养温度之间呈显著负相关,最适温度为20℃,铲状菱形藻在10℃时的总脂肪含量最高,高于最适温度总脂含量降低.脂类是生物体内非常重要的一类化合物,包括色素、固醇、甘油脂和脂肪酸等,微藻中的主要脂肪种类是极性脂和三酰甘油.极性脂大部分为磷脂和甘油脂,含有较多的PUFAs(多不饱和脂肪酸).其中磷脂是细胞膜的主要成分,甘油脂是类囊体膜的主要组分,高不饱和脂肪酸对于保持膜的流动性非常重要,许多微藻就是通过增加不饱和脂肪酸的比率来应对低温的;三酰甘油通常含有较高比例的饱和脂肪酸及单烯酸,是脂肪酸的重要储存形式,它大部分是从CO2从头合成的,在温度较低时更容易合成和积累.低温能促进微藻合成较多的多不饱和脂肪