高浓度臭氧对蒙古栎叶片抗氧化能力的影响

高浓度臭氧对蒙古栎叶片抗氧化能力的影响

近年来，近地表土壤中的氧气浓度显著增加，地表径流中的o3浓度每年增长0.5%。一旦接触到植物叶片，就会产生活性氧和过氧化氢，这会影响细胞和细胞。降低植物的光合率，改变植物光合产物的分配，并影响植物的次生代谢过程，如植物的共生代谢。次生代谢是植物体内重要的生理过程,其产物作为生理代谢的物质基础,在植物对物理、化学环境的响应和反馈过程中起着重要作用,具有重要的生态学意义.酚类化合物是次生代谢的主要产物,包括总酚、单宁、类黄酮等.国外很多学者对高浓度O3条件下树木酚类物质含量的变化进行了研究,但是结果并不一致,有的研究认为高浓度O3可使树木体内酚类物质的含量增加,有的研究则认为高浓度O3对树木体内酚类物质含量没有影响.蒙古栎(Quercusmongolica)为壳斗科栎属,是东北次生落叶阔叶林的主要组成树种和我国主要用材树种,也是沈阳城市森林中的重要树种.本文采用开顶箱气室(open-topchamber,OTC)进行模拟,研究高浓度O3处理后蒙古栎叶片次生代谢物质含量的变化,并使用1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)法对蒙古栎抗氧化能力进行了测定.旨在探讨高浓度O3条件下蒙古栎叶片次生代谢的变化,为林业管理和城市绿化等部门制定相关政策提供理论依据.1材料和方法1.1蒙古栎人工林自然生态试验oct设计试验区位于沈阳市中心的南运河中段的中国科学院沈阳树木园(41°46′N,123°26′E),海拔高度41m,占地面积5hm2.该地区属暖温带半湿润季风型大陆性气候区,年平均气温7.41℃,极端最高气温38.31℃,极端最低气温-30.51℃,年平均降水量755.4mm.植物区系隶属于长白植物区系、华北植物区和蒙古植物区系交汇处.本研究采用开顶箱(OTC)法.试验设施主要为开顶箱(直径4m、高3m)及与其配套的通气、通风设备.包括:臭氧发生器(GP-5J,国产)、臭氧传感器(S-900,新西兰)、温湿度传感器,以及数据分析与自动控制充气系统.在整个试验期间,气室内实际O3浓度(EO)控制在(80±8)nmol·mol-1,为对照(CK)(自然O3浓度,约40nmol·mol-1)的2倍.2008年6月13日开始通气,O3熏蒸时间为每天8:00—16:00,2008年6月28日取样分析,共处理15d.选取5年生蒙古栎为试验对象,每个箱内7株植株,每个处理设3次重复,共6个开顶箱.整个处理期间,各箱内管理方法相同,定期浇水施肥,防止干旱及贫瘠发生,条件控制一致.1.2总酚、总酚的制备取样时间在9:00左右(O3熏蒸15d),选取蒙古栎一年生成熟叶片,采集后分成鲜样及干样两部分:鲜样用打孔器打孔并称取0.2g置于液氮保存;鲜样用于测定丙二醛(MDA)含量,采用硫代巴比妥酸(TBA)法;另一部分置于室温下通风阴干(约25℃)粉碎,过40目筛,准确称取0.2g样品,用甲醇(液料比40∶1)于40℃超声波振荡浸提1h,浸提后5600×g离心,上清液备用.总酚采用Folin-ciocalteu法(F-C法)测定,并以没食子酸为标准品(天津化学试剂厂)绘制标准曲线;类黄酮采用三氯化铝显色法测定,以芦丁为标准品(Sigma,美国);缩合单宁采用盐酸-香草醛法测定,标准品使用儿茶素(Sigma,美国).总酚、类黄酮、缩合单宁含量以标准品没食子酸、芦丁、儿茶素的相对含量表示.1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)是一种稳定的有机自由基,购于美国Sigma公司.DPPH法是一种快速、简便的评价外源抗氧化剂和植物抗氧化能力的方法.本研究通过检测蒙古栎的叶提物对DPPH自由基的清除能力,检测蒙古栎叶抗氧化能力的变化.蒙古栎叶片提取物对DPPH的清除能力以每克干物质量样品可以清除的DPPH毫克数表示.使用甲醇提取液测定蒙古栎叶片总酚、类黄酮和缩合单宁含量以及DPPH自由基清除能力,每个指标重复测定3次.1.3处理数据试验数据使用Excel2003进行计算,使用SPSS13.0统计软件进行差异显著性检验和相关性分析.2结果与分析2.1蒙古栎叶片的a含量由表1可以看出,高浓度O3熏蒸处理的蒙古栎叶片中MDA含量与对照差异不显著,表明高浓度O3没有使蒙古栎叶片受到氧化伤害;高浓度O3处理后蒙古栎叶片总抗氧化能力上升了91.25%,变化达到显著水平(P=0.001).2.2缩合单晶含量高浓度O3处理的蒙古栎叶片中总酚、类黄酮和缩合单宁含量分别比对照提高了48.17%、24.66%和26.77%(图1),且总酚和单宁含量达到显著水平(P<0.05).2.3蒙古栎叶片醇提物对dpph的清除作用以蒙古栎叶片醇提物对DPPH清除能力表示蒙古栎总的抗氧化能力,并将对照与处理的蒙古栎叶片醇提物对DPPH清除能力与对应的总酚、类黄酮、缩合单宁含量做Pearson相关分析,结果显示:蒙古栎叶片醇提物对DPPH清除能力与叶片中总酚和缩合单宁的含量呈极显著的正相关关系,而且缩合单宁比总酚具有更好的相关性;类黄酮含量与叶片醇提物对DPPH清除能力相关不显著(P>0.05)(表2).这表明总酚和缩合单宁与蒙古栎的抗氧化能力显著相关,而与类黄酮不相关.3对蒙古栎叶片抗氧化能力的影响高浓度O3会对植物产生胁迫.O3进入植物细胞后会产生活性氧产物,对植物细胞产生毒害作用,影响其正常的生理功能,甚至引起细胞死亡.酚类物质是植物体内主要的次生代谢物质,也是植物体内重要的防御物质.酚类物质的酚羟基容易被氧化,因此通过还原反应可以降低环境中的氧含量.Yamaji等研究表明,高浓度O3使桦树叶片合成大量酚类物质,与本研究结果相一致;单宁作为氢供体可以释放出氢与环境中的自由基结合,中止自由基引发的链锁反应,从而阻止氧化过程的继续传递和进行,因此其具有很强的清除自由基的能力.但是Peltonen等的结果表明,高浓度O3虽显著增加了桦树叶片中单宁等酚类物质含量,但是单宁与桦树抗氧化能力无关;Lindroth等认为,高浓度O3对桦树叶片中单宁含量没有显著影响.而本研究结果中,高浓度O3显著增加了蒙古栎叶片中单宁含量,且单宁的含量与蒙古栎抗氧化能力显著相关,说明O3可能通过促进酚类物质的合成来增强蒙古栎叶的抗氧化能力.类黄酮是一种有较强的抗氧化能力的次生代谢物.Saleem等研究表明,高浓度O3显著增加了桦树中黄酮等酚类物质含量,但本研究中O3并没有使类黄酮含量明显增加,可能是因为合成类黄酮比合成其他酚类物质需要消耗更多的光合产物和能量,而最佳防御假说(optimumdefense,OD)认为,植物次生代谢物质的产生是以减少植物生长为成本的,只有在次生代谢物质所能获得的防御收益大于植物生长获得的收益时,植物才产生次生代谢物质,因此,蒙古栎可能有选择地去合成其他低成本的抗氧化物质如单宁等来抵御O3胁迫.DPPH自由基的清除能力可以反映植物的抗氧化能力.O3处理后,蒙古栎叶提取物对DPPH自由基清除能力提高,而且DPPH清除能力与总酚和单宁的含量显著相关,从而证实了蒙古栎叶片中的总酚和单宁在响应高浓度O3胁迫中起到重要作用,其含量的增加有助于提高蒙古栎叶片的抗氧化能力.MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一,具有很强的细胞毒性,对细胞膜和细胞中的许多分子如蛋白质、核酸和酶等有破坏作用,其含量的增加可作为细胞膜受破坏的标志之一.本研究中,高浓度O3并没有引起蒙古栎叶片MDA的变化,表明蒙古