6种常见海洋微藻硝酸还原酶活性测定方法的比较

6种常见海洋微藻硝酸还原酶活性测定方法的比较

氮是海洋浮游植物生长和繁殖所必需的养分，它是许多海拔高度影响浮游植物生长的因素。大量研究表明,在许多海区硝酸盐是浮游植物中氮的主要来源。硝酸盐经浮游植物吸收后,在体内经过一系列酶的还原作用,最终转化成为氨氮后合成其它有机物质。硝酸还原酶(EC.1.6.6.1,缩写NR)是1种胞内酶,普遍存在于细胞质内,可在电子供给体还原型辅酶I(NAD(P)H)的参与下将硝酸盐还原成亚硝酸盐,是硝酸盐同化中第一个酶,也是限速酶,处于植物氮代谢的关键位置,其活力的大小直接影响了硝酸盐的生物利用度,在海洋生态系统氮循环过程中占有极其重要的地位。文献报道的硝酸还原酶活性(Nitratereductaseactivity,NRA)测定方法总体上可分为2种:离体法(invitromethod或cell-freemethod)和活体法(invivomethod或insitumethod)。现有文献中,大部分研究者仅采用上述2种活性方法中的1种测定了不同海洋微藻的NRA,只有少数研究涉及了2种方法的比较,但不同研究所得结果缺乏一致性,因此,针对不同的海洋微藻,确立合适的NRA测定方法是十分必要的。本文对6种常见海洋微藻NRA测定的离体法和活体法测定条件进行了初步探讨,并在此基础上对2种测定方法进行了分析比较,以期能确立适合所选藻种的NRA测定方法,为进一步开展它们的NR研究奠定基础。1材料和方法1.1浮游植物的培养所用藻种塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)、东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、强壮前沟藻(Amphidiniumcarterae)、中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、新月菱形藻(Nitzchiaclosterium)、旋链角毛藻(Chaetoceroscurvisetus)均为中国海洋大学海洋污染生态化学实验室保存种。浮游植物的培养采用f/2营养液配方,培养条件:温度(20±1)℃,明暗周期12h∶12h,光源为白色日光灯,光照强度约为40μmol·m-2·s-1。在培养过程中,培养液及培养器皿采用蒸汽灭菌器于121℃加热20min进行湿热灭菌。1.2no2-n量的检测硝酸还原酶活性的测定方法参考Berges和Harrison于1995年建立的离体法及2000年Hung等人改进的活体法进行。其活力以单位时间内所生成的NO2-N量或NADH的消耗量来表征。其中NO2-N生成量采用磺胺—α-萘乙二胺显色比色法测定,于540nm下测定吸光值(A540);NADH消耗量以340nm下测定的吸光值(A340)来计算(A340=εcl,式中ε=6.22mmol·L-1·cm-1)。1.3藻细胞破碎程度的测定取一定体积的藻液,于5000r/min下离心,并以pH7.9的磷酸缓冲溶液(PO3−443-:200mmol·L-1)洗涤、离心2次获取藻细胞。将藻细胞置于组织研磨器中,加入提取液进行匀浆研磨不同时间后,考查藻细胞的破碎程度。藻细胞的破碎程度以完整细胞数目的降低来衡量,计数方法为显微镜目视计数法。各藻种设平行实验3组,具体匀浆时间见表1。1.4反应时间对nra藻细胞采用WhatmanGF/F玻璃纤维膜(Ф25mm)减压过滤收集。将样品置于装有1cm3pH7.9的磷酸缓冲溶液(PO3−443-:200mmol·L-1)和50mm3甲苯的烧杯内,于漩涡振荡器上振荡不同时间后,参照文献加入反应物,设定反应时间为5min,测定NRA。各藻种设平行实验3组,具体振荡时间见表1。1.5nadh与no2-n生成量的检测取一定体积的不同藻种的藻液,参考1.3及1.4所确立的提取时间和振荡时间,分别采用离体法和活体法在室温下测定NO2-N生成量(或NADH的消耗量)与酶促反应时间的关系,以确定进行NRA测定时所需的最佳时间。各藻种设平行实验3组。2结果与讨论2.1藻细胞破碎程度不同藻种的细胞破碎程度随研磨时间的变化见图1。由图1可知,本实验所选用的6种海洋微藻在提取液中研磨5min后,90%以上的藻细胞已经破碎。藻细胞破碎程度视藻种的不同而有所变化,其中强壮前沟藻和东海原甲藻较难破碎(破碎程度分别为90.6%和92.5%),塔玛亚历山大藻破碎最完全(破碎程度达到100%)。因此,可将提取时间设定为5min。2.2间的关系介绍在6种海洋微藻NRA活体法实验中,NO2-N生成量与振荡时间的关系如图2所示。从图2中可以看出,虽然各藻种NO2-N生成速率不同,但振荡时间达到6min后,各藻NO2-N生成量随时间的变化都很小,所以,可将振荡时间设定为6min。2.3种藻nra的线性关系图3表明了不同藻种采用离体法和活体法进行NRA测定时,NO2-N生成量(或NADH的消耗量)与酶促反应时间的关系,其中东海原甲藻及塔玛亚历山大藻的离体法实验测得的NRA以NADH的消耗量表示,其余实验均以NO2-N的生成量来表征。根据1.2所述的硝酸还原酶活力表征方法可知,NRA的测定必须在NO2-N生成量(或NADH的消耗量)与时间呈现线性关系的时间范围内进行,其直线斜率即为NRA。以新月菱形藻和东海原甲藻离体法为例进行说明。由图3A和3B可知,采用离体法测定上述2种藻NRA时,当酶促反应时间分别超过40min和45min时,NO2-N生成速率或NADH消耗速率明显减慢,NR开始失活。因此,在以离体法测定此两种藻NRA时,所选择的酶促反应时间应分别<40min和45min,否则,计算的NRA在数值上必然低于真实值。另外,对于中肋骨条藻和旋链角毛藻,当采用离体法测定NRA时,在实验设定的时间内,均表现了良好的线性关系(见图3a),提示在实验条件下,2种藻的NR活性没有降低,但不排除当反应时间延长时,NR失活的可能性。各海洋微藻2种方法测定NRA的线性时间见表2。从以上分析可以看出,6种海藻的NR间存在着种属差异。若确定各藻通用的酶促反应时间,需选择真正能体现各藻种NRA活性的时间,综合比较各海藻的线性时间可得:当采用离体法测定NRA时,酶促反应时间应设定为30min;采用活体法测定NRA时,酶促反应时间应设定为10min。但此时间是否适用于其它的海洋浮游藻类,还有待于进一步研究。2.42样品的提取:从提取nr到激活nra对于实验涉及的每种海洋微藻,取同样体积的相同藻液,分别采用离体法和活体法进行NRA测定,酶促反应时间如上文所述:离体法为30min,活体法为10min,所得结果见表3。在表3中,为方便进行2种方法NRA测定结果的比较,将离体法所得的NRA定为100,活体法NRA所示数值则为相对于离体法NRA所得的相对值。结果表明:除东海原甲藻外,对于其余5种海洋单细胞藻,离体法测得的NRA均较活体法高,2种方法NRA视藻种的不同相差倍数在1.23～4.17之间,差异显著(n=8,t-检验,塔玛亚历山大藻:P<0.05;其余各藻P<0.01)。另外,对比2种方法的实验精度可知,相对于活体法,离体法具有更好的重现性和精密度(见表3),这与Hochman等人的研究结果相反。但Hochman采用的离体法为Eppley或Packard建立的方法,活体法为Hochman本人所建立,与本文方法略有不同。离体法是在加入提取液后通过破碎藻细胞来提取NR的方法,在相同的实验条件下,提取液的组分会对NRA的测定值产生一定的影响。与Eppley或Packard的离体法相比,本文采用的Berges建立的离体法提取液中增加了EDTA、曲拉通X-100及BSA等3种组分,其中,EDTA可通过络和作用消除金属对NR的失活作用;表面活性剂曲拉通X-100可将离心废渣中残余的NR充分提取出来;BSA可降低蛋白酶对NR的分解作用,能更好地降低NR在提取过程中造成的损失。实际上,Berges离体法是Eppley或Packard离体法的改进方法。活体法是加入合适的试剂增加细胞壁(膜)的通透性,使生成的NO2-N扩散到反应液进行NRA测定的方法。本文所用的活体法与Hochman活体法的区别在于在加入反应物后加以振荡以加速NO2-N的扩散,进而提高NRA的测定值。通过以上的分析可以看出,在Hochman的研究中,无论是采用离体法还是活体法测得的NRA均存在低估的可能性,这也是引起Hochman的研究结果与本文研究结果不同的主要原因。对于东海原甲藻而言,虽然在本文条件下,离体法所测NRA小于活体法,并且存在明显差异(n=8,t-检验,P<0.01),但并不能说明,活体法较离体法更适用于东海原甲藻的NRA测定。对于NR这种多辅基(酶)的细胞内酶而言,在离体法提取过程中,结合较松的辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)会从NR亚基上发生不同程度的脱落,其脱落程度也存在着种属差异,在反应液中适量添加FAD可明显提高某些藻种的NRA,但对某些藻种却没有影响。而活体法直接采用鲜活细胞进行测定,实验过程中保持了NR结构的完整性,未引起辅酶FAD含量的降低。据此推测,在本文条件下东海原甲藻离体法测得的NRA相对较低的原因,可能是辅酶FAD在提取过程中的缺失所致。因此,离体法和活体法在东海原甲藻NRA测定上的优劣还有待于进一步研究。离体法和活体法是2种原理不同的方法,在进行NRA测定时各有利弊。离体法在NR提取过程中,因藻种的不同,会造成某些藻NR的一些辅助因子如:NADH,FAD的缺失,且缺失程度存在种属差异;另外,细胞中NR的提取效率及其活性保持程度也会受到提取液成分的影响,可能会引起某些藻种NRA的测定值低于真实值。但离体法保证了各底物在酶促反应过程中的充分接触及生成产物的及时释放,实验精密度好。活体法是在增加细胞壁(膜)通透性、提高底物NO3-N、NADH和反应产物NO2-N进出藻细胞速率的基础上建立的,虽然保全了NR的结构,但细胞壁(膜)通透性的提高程度、底物和反应产物进出藻细胞的速率、NO2-N生成后被藻细胞吸收、同化的速率都将对活体法测得的NRA有重要影响,导致活体法实验可控性差、重现性低,本文的实验证实了这一点。综合考虑2种方法测得各藻NRA的表观值和实验精度,离体法取得了让人满意的结果。但本文条件下的离体法实验没有考虑FAD缺失所带来的影响,所得NRA值可能会低于实际值,因此,离体法实验条件还有待于进一步优化。3海洋微藻nr活性的测定作者采用Berges和H