硫酸铵溶液饱和度

南京农业大学生命科学学院生物化学技术原理及应用第二章沉淀法沉淀法是纯化生物大分子常用的一种经典方法。该法操作简单，成本低廉，一般包括盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。2023/9/11南京农业大学生命科学学院22023/9/11生命科学学院生物科学51班3第二章沉淀法基本原理蛋白沉淀法123核酸沉淀法第一节沉淀的基本原理沉淀法也称溶解度法。其纯化生物大分子的基本原理是：根据各种物质结构的差异（如蛋白分子表面的疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），就能致使抽提液中有效成分溶解度的变化。则可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分离的目的。2023/9/11南京农业大学生命科学学院42023/9/114南京农业大学生命科学学院第一节沉淀的基本原理蛋白沉淀法：

盐析法有机溶剂沉淀法蛋白质沉淀法核酸沉淀：有机溶剂沉淀法等电点沉淀法其它沉淀剂沉淀法：聚乙二醇（PEG），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），LiCl，精胺，钙盐。2023/9/11南京农业大学生命科学学院55南京农业大学生命科学学院聚乙二醇沉淀法选择性沉淀法结晶沉淀法第二节蛋白沉淀法1.盐析法原理：根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶）但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。

2023/9/11南京农业大学生命科学学院66南京农业大学生命科学学院2023/9/11南京农业大学生命科学学院72023/9/11南京农业大学生命科学学院8第二节蛋白沉淀法1.盐析法盐的选择一般蛋白沉淀时选用硫酸铵，原因：溶解度大，对温度不敏感分级效果好有稳定蛋白质结构的作用价格低廉，废液可以肥田盐析的缺点：样品继续纯化时须脱盐。硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。2023/9/11南京农业大学生命科学学院99南京农业大学生命科学学院第二节蛋白沉淀法1.盐析法硫酸铵盐析固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当达到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀下来。饱和溶液法。较固体法温和，但不适用于大体积样品，会导致样品体积大量增加。透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。该法盐浓度以连续状态变化，避免局部盐浓度过高的不良影响，分级效果好。但受透析袋容积、盐析速度、及硫酸铵耗费大的制约，仅用于精确、样品体积小的试验中。2023/9/11南京农业大学生命科学学院1010南京农业大学生命科学学院硫酸铵盐析固体法g=533(S2-S1)/(100-0.3S2)(20℃)g=541(S2-S1)/(100-0.3S2)(20℃)g：1升溶液中需加入固体硫酸铵的克数S1：表示需要达到的百分饱和度S2：表示原溶液中的百分饱和度饱和溶液法V=V0(S2-S1)/(S3-S1)V：表示需要加入的硫酸铵溶液体积（ml）V0：表示原来溶剂的体积（ml）S1与S2同上S3：表示需要加入的硫酸溶液的饱和度2023/9/11南京农业大学生命科学学院1111南京农业大学生命科学学院硫酸铵分级沉淀示例：各溶解度区段的沉淀效果（尿素酶）：2023/9/11南京农业大学生命科学学院12名称沉淀效果硫酸铵饱和度/%（25℃）0~2525~3535~4545~5555~65沉淀物酶活力单位/U011268503020272023/9/11南京农业大学生命科学学院13调整硫酸溶液饱和度计算表第二节蛋白沉淀法1.盐析法盐析的影响因子：蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般控制样品液蛋白浓度在0.2%-2%为宜。离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。2023/9/11南京农业大学生命科学学院1414南京农业大学生命科学学院盐析的影响因子：ＰＨ对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将ＰＨ值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在０~４℃操作。其他：在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加入一定量EDTA，以除去沉淀剂中带入的金属离子。再者是加硫酸铵的时间要控制好，一般2h左右。2023/9/11南京农业大学生命科学学院1515南京农业大学生命科学学院第二节蛋白沉淀法2.有机溶剂沉淀法原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。2023/9/11南京农业大学生命科学学院1616南京农业大学生命科学学院2023/9/11南京农业大学生命科学学院17第二节蛋白沉淀法2.有机溶剂沉淀法常用溶剂：甲醇、乙醇、丙酮。优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。2023/9/11南京农业大学生命科学学院1818南京农业大学生命科学学院第二节蛋白沉淀法3.蛋白质沉淀法针对某一类或某一种蛋白的沉淀法，常见沉淀剂有：碱性蛋白质：多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效沉淀核酸外，还能沉淀某些蛋白质。凝集素：凝集