大肠杆菌表达载体的构建与应用

大肠杆菌表达载体的构建与应用

原始梢表达系统和真实梢表达系统都有各自的优缺点。前者是最早被采用,也是目前研究最清楚的表达系统,其中大肠杆菌表达系统是外源基因表达的首选。真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。在各种表达系统中,最早采用的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术主要是将已克隆入目的基因片断的载体转化细菌(一般是大肠杆菌),通过诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白。其优点是能够在较短时间内获得基因表达产物,且所需的成本相对较低。大肠杆菌的遗传背景清楚,又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点,成为外源基因的首选表达系统。1.1融合表达载体的构建表达系统的核心是表达载体。目前已知的大肠杆菌表达载体至少有以下几种:非融合型表达、融合型表达、分泌型表达。若按启动子类型分,目前广泛使用的大多数质粒表达载体主要是由λ噬菌体的PL启动子、大肠杆菌乳糖操纵子的lac启动子、色氨酸操纵子的trp启动子,以及pBR322质粒的β-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。非融合型表达优点在于:表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致,从而可以进行后续研究。为了提高翻译效率,人们在设计表达载体时采用了许多办法:优化翻译起始区以达到高效表达、构建一套SD-AUG间隔不等的表达载体cassette,以供选择利用。在构建表达载体时,使用“原核翻译增强子”序列,以提高翻译效率。鉴于野生型大肠杆菌基因多以多顺反子形式来组织,故采用双顺反子表达载体来获得目的基因的表达;将“原核翻译增强子”和双顺反子结合到一起,从而提高表达效率。融合表达载体通常SD-AUG已固定,翻译起始信号组织合理,利于翻译起始;简化蛋白分离纯化工艺;可增强mRNA及表达产物的稳定性;有些蛋白质融合表达产生可溶性蛋白。目前成功的融合表达系统主要有:①GST系统:融合蛋白通过谷胱甘肽——agarose进行亲和纯化后,用凝血酶或Xa-因子切除融合蛋白的GST部分,获得目的蛋白。但是并非所有GST融合蛋白都是可溶的。切割后目的蛋白N端一般残留两个氨基酸,且切割效率不高。②β-半乳糖苷酶系统:通过蓝白斑筛选得到目的克隆,融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶(TPEG)——Sepharose进行亲和纯化。③麦芽糖结合蛋白(MBP)系统:某些目的蛋白与MBP融合后可分泌到外周质中,通过直链淀粉交联纤维素亲和层析分离纯化。④金黄色葡萄球菌蛋白A系统:通过IgG——Sepharose亲和层析分离纯化,融合蛋白由HIV-1蛋白酶切割。陈燕等将胰岛素原基因融合到金黄色葡萄球菌蛋白A的基因上,构建成大肠杆菌的融合外分泌表达载体;结果高效分泌表达,能方便地从培养基中分离得到具天然结构的胰岛素原。⑤纯化标签融合:如FLAG-tag和His-tag,甚至将GST、His置于同一个表达载体中,进行双标签表达,检测、纯化更容易。⑥其他融合系统,如硫氧还原蛋白等。1.2蛋白质分离和代谢真核基因在大肠杆菌中的表达形式一般可分为3类:细胞内不溶性表达,即以包涵体形式存在;细胞内可溶性表达;蛋白分泌型表达。包涵体的形成是细胞内表达最大的问题,它是细菌表达的蛋白在胞内相互凝集而形成的无活性固体颗粒,具很强的折光性。包涵体的形成是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合,致不形成成熟的天然或完全解链的蛋白。包涵体虽然利于分离纯化,但是对表达产物的活性不利。涉及包涵体形成的主要理化因素有:电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸和脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。为了克服包涵体的形成,常在表达外源基因的同时,共表达分子伴侣和折叠酶。分子伴侣是细胞内催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子,能识别、结合并稳定部分折叠的蛋白中间体,避免不适当的分子间及分子内作用;而它本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成部分。大肠杆菌细胞中存在三种具有广泛特异性的伴侣复合物:一是由10kD的GroES与60kD的GroEL两种热休克蛋白(Hsp)组成的GroES/EL;二是由DnaK(Hsp70)与DnaJ、GrpE组成的伴侣复合物,新生肽链通过与DnaJ作用被DnaK识别,再与GrpE结合;第三种是Cip系统(CipA与CipX),它的作用可能是识别易被降解的未折叠肽。折叠酶是指那些催化蛋白质特定异构反应的酶,限制蛋白质折叠的速率。大量表达这些酶可以促进重组蛋白在大肠杆菌中的正确折叠。大肠杆菌中研究最多的折叠酶是二硫键异构酶DsbA(disulfateBindingProteinA),其功能依赖于膜蛋白DsbB。共表达有两种方法:一是采用双顺反子或多顺反子系统,将不同基因连同各自的SD序列串连在一起,克隆在同一启动子下游;或将不同亚基的表达单元,包括各自的启动子、SD序列和结构基因串连起来。另一种方法是将不同基因克隆到两个相容表达载体中,通过共转化实现不同亚基在同一宿主中的共表达。Caspers等人将酪氨酸激酶Csk、Fyn或Lck等与DnaK、DnaJ、GroES等共表达,得到了可溶蛋白。此外,还可通过改变发酵条件,如降低发酵温度、加入不能代谢的糖、降低培养基的pH值等来改善蛋白的溶解性。蛋白分泌型表达又可根据表达场所的不同分为周质分泌表达和胞外分泌表达。所谓周质是指在大肠杆菌一类革兰氏阴性细菌中,位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在大肠杆菌中,已成功使用了各种不同类型的信号肽,将细胞质中表达的蛋白质转运到周质,如PhoA、OmpA、OmpT、LamB、β-内酰胺酶、肠毒素ST-Ⅱ、LT-A、LT-B、金黄色葡萄球菌蛋白A、人生长激素信号肽等。氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,获得具完全生物活性的重组蛋白。一些可被细胞内蛋白酶降解的蛋白质在周质中稳定性提高。但周质空间小,有时会发生二硫键的错配。胞外表达使重组蛋白分泌到胞外培养基中进行分离纯化,便于大规模培养。目前使外源蛋白分泌到培养基的系统主要有α-溶血素(haemolysinA,HLyA)系统和大肠杆菌素释放蛋白(bacteriocinreleaseprotein,BRP)系统。郭斯若等还报道了一种L-型细菌蛋白表达系统。L-型细菌缺乏细胞壁,通过连接合适的信号肽,可以用于许多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表达,表达产物直接分泌到培养基中。1.3外源基因的转录调控及基因表达效率主要影响因素有:密码子的使用、增强子的使用、mRNA的稳定性及翻译起始效率、启动子的选择、载体选择、蛋白酶的影响等。原核生物中,由于不同tRNA含量上的差异产生了对密码子的偏爱性。经统计发现:AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子。蛋白翻译过程中,如果稀少密码子连续出现,会抑制蛋白质合成,发生密码子错配。因此对含较高比例稀有密码子的外源基因进行表达时,应针对密码子的偏爱性采取措施,如用非连续性多核苷酸定点突变方法对cDNA中稀有密码子进行同义突变,或提高某种氨基酸的tRNA浓度。GSrimivasan等报道Methanosarcinabarkeri甲胺转甲基酶基因中UAG密码子编码了一个赖氨酸衍生物。故在重组蛋白表达时应避免使用UAG作终止密码子,防止转录过程的通读。已知大肠杆菌格外偏爱终止密码子UAA,尤其当在其下游连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况下,转译终止的效率会进一步加强。增强子是基因表达的重要调控元件,在原核细胞中也发现类似增强子序列,在一定程度上能提高大肠杆菌系统的表达效率。罗文新等用T7启动子和Ω序列对PET24(+)载体的转录调控区进行改造,并通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)来检测表达效率,结构表明Ω序列能显著增强PET24(+)载体的表达效率。mRNA的稳定性与外源蛋白的合成有很大关系,也是影响表达效率的重要因素之一。转录出的mRNA5′上游的SD序列与ATG间的碱基数和碱基组成对目的基因的翻译效率很重要。有报道认为,间距以6-11个碱基最好,碱基组成以C+G比例不超过50%为好。说明SD序列与ATG间的距离适当,能更有效地促进翻译的效率。一般认为,降低翻译起始区(TIR)二级结构的稳定性可以提高mRNA的稳定性,利于外源基因的表达。沈芸等通过改变原有载体的TIR区的序列,成功构建出了一个高效表达的载体。在大肠杆菌的表达系统中,通过采用可诱导的强启动子,多数情况下真核基因可得到有效的转录。目前构建的表达载体一般都采用较强且易于诱导的启动子,如PL、Lac、Tac和T7启动子等。由于大肠杆菌防御系统的自身保护作用,细胞内的重组基因和蛋白可能会被其核酸酶和蛋白酶降解,这种降解作用具有一定的专一性和选择性。因此,阐明大肠杆菌中核酸酶和蛋白酶的作用规律,对mRNA和基因产物采取一定的保护措施,可以使一些原先不能在原核生物中表达的真核基因获得表达。目前已发现了一些促进mRNA稳定性的序列,如ompA基因mRNA5′端非翻译区末端的一段序列。有研究表明,大肠杆菌的重复性基因外回文序列能防止3′→5′外切酶的作用,进而能稳定mRNA并提高表达水平。另外,Invitrogen等公司都已经开发出蛋白酶缺陷型菌株,以减少外源蛋白被降解的可能,从而提高重组蛋白的表达水平。2原核及真核系统的翻译后的化学计量特征虽然原核表达技术已十分成熟,且能在较短的时间内获得基因表达产物,但还存在许多难以克服的缺点,如目的蛋白常以包涵体形式表达,致使产物纯化困难;原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低等。真核系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。2.1甲醇酵母蛋白质的代谢主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统,也是目前应用最广泛的酵母表达系统,主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三种,其中PichiaPastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。甲醇酵母的表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子,醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%,所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次,在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体,一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷,另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解,pPIC9K,pMETαA、B、C均为此类载体。此外,还可使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体,形成多个表达单元,产生高产的菌株,此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时,甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,能诱导基因表达,使外源蛋白质的产量更高。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型,从而大大减少产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中表达成功,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等。有多种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的(10～100)倍。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L,而在甲醇酵母中为450mg/L,提高了60倍。据报道,外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L。国内也有较多在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入,它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。2.2外源基因调控蛋白表达的作用昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化变得困难。另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难,Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统,该系统主要包括三个调节外源蛋白表达序列:①丝蛾Bombyxmori的肌动蛋白基因启动子;②B.mori的核型多角体病毒(BmNPV)的ie-1基因(编码IE-1蛋白,作为转录激活因子,在体外激活肌动蛋白基因启动子);③BmNPV的同源重复序列3(HR3,可作为肌动蛋白基因启动子的增强子)。三者协同作用,从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外,一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建,该病毒由AcNPV及BmNPV发展而来。Lee等构建了杆状病毒-S2表达系统,该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞,不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似。因此,杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。张志芳等研究发明了一种利用昆虫激素提高昆虫/杆状病毒表达系统外源基因表达效率的方法,包括应用昆虫蜕皮激素(MH)、昆虫保幼激素(JH)及MH和JH的联合使用以提高外源基因和多角体蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达效率,以及昆虫杆状病毒在昆虫细胞中的复制效率。通过这种方法可以大大提高外源基因和多角体蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达效率,增加外源蛋白和多角体病毒粒子产量,节约生产成本。2.3诱导细胞外源基因表达由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统。哺乳动物表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。将外源基因导入哺乳动物细胞的方法主要有:一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等非病毒载体的方法。利用哺乳动物细胞表达外源基因时,一般不需要诱导;但当表达产物对细胞有毒害时应采取诱导。诱导型载体主要与启动子有关,如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导。朱晓东等构建了由四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,结果利用四环素诱导可有效地提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达。外源蛋白的表达有时会对哺乳动物细胞产生不利影响,导致外源基因不能稳定表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物细胞中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统,无序繁琐的