rrhpi-pqe40ecolim15高效表达系统的建立及发酵条件优化

rrhpi-pqe40ecolim15高效表达系统的建立及发酵条件优化

广泛用于构建互补基因的细菌，并获得大量外源基因的产物。用质粒pQE-40构建了(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原[(His)6-Arg-Arg-humanproinsulin,RRhPI]的大肠杆菌表达系统。RRhPI经过复性酶切等下游纯化工艺可加工成具有天然生物活性的重组人胰岛素。因此,探索在重组大肠杆菌中外源基因RRhPI表达的发酵工艺,使之高密度、高产率和高浓度培养,最终得到高表达的RRhPI,是提高重组人胰岛素产率的方法之一。实现基因工程菌的工业化生产,除了构建高效的载体-宿主系统外,基因工程菌的发酵过程控制也十分重要。为此,特采用正交优化工艺探索了基因工程菌(RRhPI-pQE40E.coliM15)高密度发酵的影响因素和发酵工艺。1实验部分1.1微生物E.coliM15及质粒pQE-40(QIAGEN),胰蛋白胨(Oxoid)和酵母浸出汁(上海棱光酵母制品有限公司);氨苄青霉素(华北制药股份有限公司);卡那霉素(AMRESCO分装);异丙基-β-D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG,BBI分装);低分子量蛋白标准(上海东风生物技术有限公司);其余为国产分析纯。1.2rrhpi-pqe-colim15湿菌体的制备1.2.1重组体RRhPI-pQE40E.coliM15的构建及筛选以人胰腺cDNA文库为模板,特定设计的寡核苷酸段链为引物,PCR扩增hPI的编码序列;hPI基因pQE-40质粒分别被限制性内切酶BamHI和HindⅢ同时酶切产生黏性末端;在低温(16℃)条件和T4DNA连接酶的作用下,hPI基因和pQE-40质粒通过黏性末端互补形成重组DNA;重组DNA转化E.coli感受态细胞M15。随机挑取转化单克隆,在LB/AK培养基(氨苄青霉素100μg·ml-1和卡那霉素50μg·ml-1)中进行培养,用0.5mmol·L-1IPTG诱导表达。1.2.2细菌的摇瓶培养摇瓶培养水平下,用优化的发酵培养基和比浊法测RRhPI-pQE40E.coliM15的生长曲线。用接种环挑取斜面保存的RRhPI-pQE40E.coliM15一环接种于3mlLB/AK培养基中,37℃,220r·min-1恒温振荡培养一段时间。取100μl菌液接种于5mlLB/AK培养基中,37℃,220r·min-1恒温振荡培养一段时间即可。活化的种子可在4℃下保存数周待用。将5ml活化种子转接到50ml优化后的发酵培养基中,恒温振荡培养一段时间。取50ml经一级发酵扩培后的菌液转接到500ml发酵培养基中,恒温振荡培养一段时间后加入IPTG诱导人胰岛素原的表达,继续恒温振荡培养一段时间后结束发酵。3×103r·min-1离心15min,沉淀即得RRhPI-pQE40E.coliM15湿菌体,于-20℃保存。采用正交法,结合摇瓶发酵工艺的前期研究,选取摇瓶培养条件中7个主要因素进行两水平正交优化,7个因素为种子活化方式、摇床转速(通风量)、IPTG诱导温度、接种量、IPTG添加量、诱导时间和补料方式。以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量考察条件优化的效果。选用L8(27)安排,进行8次实验,对实验结果进行分析,优化出最佳实验条件,并做3次水平重复试验,分别测定每升培养基收获湿菌体的量、发酵液的A600及每升培养基收获包涵体的量。IPTG诱导基因工程大肠杆菌表达RRhPI。对诱导时间的影响进一步做了分析,基因工程菌在三角摇瓶培养至对数生长中期,加入0.5mmol·L-1IPTG进行诱导,每隔1h取样,以SDS分析RRhPI的表达情况。1.2.3细胞的2种破碎方法其一是溶菌酶/超声破碎细胞。发酵所得RRhPI-pQE40E.coliM15湿菌体,悬浮于适量缓冲液A(50mmol·L-1Tris-HCl、0.5mmol·L-1EDTA、50mmol·L-1NaCl、5%甘油、0.1～0.5mmol·L-1DTT、pH7.90)中,加入溶菌酶(5mg·g-1湿菌体),室温或37℃振荡2h。在冰浴中超声(10s×30),每次间隔20s,功率200W。其二是超声破碎细胞。大肠杆菌湿菌体悬浮于适量的缓冲液A中,充分溶解,冰浴超声(40s×10),每次间隔30s,功率200W。两种破碎方法所得包涵体洗涤后作SDS。洗涤时均先后用含2mol·L-1尿素的缓冲液和含2%脱氧胆酸钠(DOC)的缓冲液各洗涤1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗两次。1.2.4包涵体的3种洗涤方法溶菌酶/超声破碎细胞的裂解液于4℃、1.4×104r·min-1离心15min,收集沉淀。洗涤方法一是将此沉淀用2mol·L-1尿素的缓冲液充分溶解,离心收集沉淀;沉淀再用2%DOC的缓冲液洗涤,离心,所得沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵体,于-20℃保存。方法二则用缓冲液充分洗涤沉淀两次,收集沉淀保存。方法三用2%DOC的缓冲液洗涤1次。再用10mmol·L-1Tris-HCl清洗两次,离心收集沉淀保存。取上述不同方法洗涤的沉淀,用SDS检测洗涤效果。1.3结果1.3.1rrbol-pqe40的rr公式用于构建1.3.2rrhpi-pqe.colim15在iptg的诱导表达在摇瓶培养水平下,采用优化的发酵培养基发酵RRhPI-pQE40E.coliM15,培养4h后即进入对数生长期,而且对数生长期可延至17h。采用优化出的最佳实验条件做3次平行验证试验。结果见表1。综合每升培养基所收获湿菌体的量(wetweight/g·L-1)和发酵液的A600两个指标,选取关键因素的最优条件,结果表明摇床转速(即通风量)与补料方式对发酵结果影响最大,IPTG的诱导时间和添加量次之。正交试验所得菌体经溶菌酶/超声破碎细胞后得到的包涵体SDS的结果见图3。RRhPI-pQE40E.coliM15表达的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在,其分子大小约为13kD,由图3可知,在正交实验条件下2、3、7、8包涵体的表达量较高。RRhPI-pQE40E.coliM15在摇瓶中培养至对数生长中期,加入0.5mmol·L-1IPTG进行诱导,每隔1h取样,以SDS分析RRhPI的表达情况(图4)。结果RRhPI-pQE40E.coliM15在IPTG诱导4～5h时,富含包涵体的湿菌体(约24kD)收率较高,相应的目的蛋白表达量较高,继续诱导并未使湿菌体表达量有所提高。因此,诱导3.5～4h既有利于富含包涵体的湿菌体及目的蛋白的表达,又可缩短发酵时间,简化生产工艺。2.3细胞破碎方法我们比较了溶菌酶/超声破碎细胞和超声破碎细胞两种方法,并进一步比较了3种包涵体的洗涤方法(图5)。结果说明“1.2.3”项中破碎方法一较好,即用溶菌酶和超声破碎结合可彻底破碎细胞,并使表达产物包涵体充分溶出。“1.2.4”项中方法一的洗涤效果优于方法二和三,即采用变性剂2mol·L-1尿素及离子型去污剂2%DOC洗涤的效果较好。3发酵罐培养的菌株活性及菌体表达利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,生物工程菌发酵的目的是希望获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载体和目的基因三者的相互关系,而且与其所处环境的条件也密切相关。因此,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索适合外源基因表达的发酵工艺。重组大肠杆菌的高密度发酵,可降低生产成本,提高生产效率。我们通过对RRhPI-pQE40E.coliM15发酵条件的优化,发现摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大。摇床转速与发酵过程中氧气的供给有直接的关系,转速越高,越能满足高密度发酵中工程菌剧烈生长繁殖所需的氧气量;及时补料则可相对延长工程菌的对数生长期,从而增加菌体数量,达到高密度发酵的目的;加入一定量的培养基,可及时起到稀释作用,消除代谢产物的抑制作用,从而促进工程菌的生长繁殖。使用发酵罐发酵时,可以通过搅拌器和加大通气量来保证细菌生长发酵所需的溶氧;发酵罐发酵采用流加式培养,可控制流加的时机和模式等,更有效地保证了菌体生长繁殖过程中营养物质的及时补充以及代谢产物的流出与稀释,促进了工程菌的高密度发酵。因此,可以预见:在优化的条件下用发酵罐培养菌体可使目的蛋白的表达量进一步提高。溶菌酶/超声破碎细胞结合了酶法破碎细胞与机械破碎细胞的方法,既可彻底破碎细胞又可避免使用DNAaseⅠ,降低了成本,简化了工艺,同时也减少了外源蛋白的引入。在洗涤包涵体时先后采用2mol·L-1尿素的缓冲液和2%DOC的缓冲液洗涤,低浓度的变性剂和离子型的去污剂的使用,洗除了大部分的杂蛋白(尤其是脂类和膜蛋白),提高了包涵