不同损伤方式诱导的兔椎间盘退变模型的比较

不同损伤方式诱导的兔椎间盘退变模型的比较

椎间盘退行性疾病（dd）是临床常见病和常见疾病，但目前关于性别和病理生理的系统尚不完全清楚。建立可靠的椎间盘退变动物模型,能够为研究DDD的发病机制提供有利条件,为治疗DDD的各种探索研究提供良好的实验载体。现已建立的各类动物模型多属诱发性退变模型,其中以通过直接损伤椎间盘结构引发退变的模型应用最广泛。但目前对不同手术损伤方式诱导的退变模型之间进行比较的研究较少,对于椎间盘退变模型的选择仍有许多不同意见。我们的研究采用生化检测和影像学检查方法,对3种不同手术损伤方法建立的椎间盘退变动物模型的退变过程及其特点进行观察和比较,以期为DDD的相关研究中动物模型的选择提供参考依据。1材料和方法1.1实验分组和分组健康6月龄新西兰大白兔25只,雌性14只,雄性11只,体重2.0~2.5kg,由四川大学华西医院动物实验中心提供。经MRI和CR检查排除脊柱的先天性畸形和椎间盘退变。随机分为18G针头纤维环穿刺组(A组)、22G针头纤维环穿刺组(B组)、髓核抽吸组(C组)、终板破坏组(D组)和假手术对照组(E组)。每组5只动物,标准条件下适应性饲养1周。1.2g头皮穿刺组所有动物以10%水合氯醛(0.3mL/kg)腹腔注射全麻。腰背部剃毛备皮约20cm×15cm后,取侧卧位固定四肢。各组均采用经侧方腹膜外入路,显露椎间盘后分别采用以下方法造模。A、B组:采用Masuda等的方法,分别用18G和22G针头在L3、4、L4、5、L5、6椎间盘进行穿刺。以针头帽制作的套筒为保护装置,控制刺入深度为5mm,由纤维环前外侧方平行终板方向刺入椎间盘中央,刺入并维持5s后拔出穿刺针。C组:用22G针头在L3、4、L4、5、L5、6椎间盘进行穿刺,方法同上,刺入后将空针活塞由0mL抽拉至2mL处保持15s,然后拔出穿刺针并逐层缝合创口。D组:以头端呈45°斜面的针头套筒为保护装置,控制穿刺角度(45°)和刺入深度(10mm),用18G针头分别在L3、L4和L5椎体中份,沿与椎体呈45°斜向下方刺入,穿破L3、4、L4、5、L5、6椎间盘的上位软骨终板,旋转2圈后拔出穿刺针。E组:为假手术组,暴露椎间盘后逐层缝合创口。所有动物分别于术前和手术结束时肌肉注射庆大霉素8万U,术后置于标准条件下自由喂养。1.3测试指标1.3.1腰椎正常组织mri扫描及分级分别于术后2、4、8、16、32周每组各随机选取1只兔,行脊柱CR及MRI检查。注意保持动物麻醉深度相同。MRI检查:采用SonataMaestroClass1.5T超导MRI扫描仪(Siemens公司,德国),对动物腰椎行矢状位T2WI扫描,用SE序列扫描参数为TR/TE3000/92ms,层厚1.5mm,间隔0mm;选择经兔腰椎正中矢状面的MRI扫描图像,以Pfirrmann改良分级法作为评估标准,记录各椎间盘分级的分值。CR检查:扫描参数为50kV,100mA,50ms;根据Kim等提出的“三中线法”,测得各手术节段(L3、4、L4、5、L5、6)椎间盘高度值为X,相邻健康节段(L2、3)的椎间盘高度值为Y,各手术节段椎间盘的相对高度H以X与Y的比值来表示。所有影像资料由放射科医师行单盲评估。1.3.2髓核组织水含量测定各时间点各组行影像学检测后,经耳缘静脉注入空气10mL处死实验动物,获取手术节段椎间盘髓核组织,—70℃下冻存备用,进行以下检测。水含量测定:采用真空冻干法测定髓核组织水含量。首先测量髓核组织湿重,再用GAMMA2-16LSC型真空冻干机(MartinChrist公司,德国)将样品在真空缸内冷冻干燥12h后称重(干重)。水含量以占髓核组织样品湿重的百分比表示,计算公式:(湿重-干重)/湿重×100%。s-GAG含量测定:采用DMMB分光光度法测定髓核组织中s-GAG的含量,以其占髓核组织样品干重的百分比表示,计算公式:s-GAG含量/髓核组织干重×100%。1.4统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK检验,P值<0.05为有统计学意义。2结果2.1组患者膝关节间隙狭窄程度的比较表1兔腰椎CR片显示各组术后2周椎间隙高度基本正常。C、D组在术后4周,A、B组在术后8周时,均开始出现明显的椎间隙降低、终板下骨质硬化;随时间延长,A~D组椎间隙狭窄程度均不断加重,上下软骨终板有不同程度钙化,椎体前缘可见骨赘形成(图1)。各时间点E组无明显改变。椎间盘相对高度结果显示,D组从术后2周,A、B、C组从术后4周开始与E组比较差异均有统计学意义(P<0.05);A、B组间各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05);见图2。2.2各组小鼠髓核信号强度在观察期的变化兔腰椎MRIT2WI检查显示,A~D组的手术节段椎间盘髓核信号强度在术后呈现逐渐降低趋势,而各非手术节段和E组的髓核信号强度在观察期内无明显变化。各组椎间盘分级分值的变化显示,C、D组从术后2周开始,A、B组从术后4周开始与E组比较差异均有统计学意义(P<0.05);A、B组间各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05);见图3。2.3各组各时间点间比较术后A~D组髓核组织水含量随时间延长呈逐渐降低趋势,见表1。C、D组从术后2周开始,A、B组从术后4周开始与E组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A、B组间仅在术后32周时比较差异有统计学意义(P<0.05)。A、B、D组术后8周内组内各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05),8周后变化不明显(P>0.05);C组术后16周内组内各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05),16周后变化不明显(P>0.05)。2.4各时间点的比较术后A~D组髓核组织s-GAG含量随时间延长均呈逐渐降低趋势,见表2。D组从术后2周,C组从术后4周,A、B组从术后8周开始与E组比较差异均有统计学意义(P<0.05);A、B组间各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)。A组s-GAG含量从术后8周开始显著下降,与术后2、4周比较差异有统计学意义(P<0.05),8周后变化趋于稳定(P>0.05);B、C组在整个观察期均呈缓慢、稳定的下降趋势,组内相邻两时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05);D组在术后8周内下降最明显,相邻两时间点间比较差异有统计学意义(P<0.05),8周后变化趋于缓慢(P>0.05)。3讨论3.1普通头皮穿刺纤维环自Lob(1933)首次制成羊椎间盘退变模型后,不同方法和不同物种的退变模型相继建立。早期的手术直接损伤模型多采用纤维环切开等方式,通过损伤椎间盘纤维环达到诱发椎间盘退变的目的。但该方法不易控制损伤程度,容易造成髓核组织的急性疝出,所诱导的椎间盘退变过程往往周期短、进展快,且可重复性差。随后该方法被学者们逐渐加以改进,近年来Masuda等提出了使用普通针头穿刺纤维环的方法,克服了上述缺点,并通过研究证实其具有操作简便、实验周期短、成功率高等优点,是目前应用较为普遍的椎间盘退变模型。对于建模物种的选择从理论上说,因猴是双足站立的灵长类动物,其身体构造、脊柱生物力学环境与人类相似度最高,是最为理想的选择,但其数量稀少、饲养困难、价格昂贵,故极少采用。与此类似,猪、犬等大型哺乳动物也因条件限制而难以大量应用于DDD的相关研究中。目前仍多以兔和鼠作为构建椎间盘退变模型的常规实验动物。本研究选择新西兰大白兔作为模型动物,具有经济、便利的特点,相对大鼠而言具有更易于获取椎间盘及分离髓核组织、更能耐受手术创伤等优点,是用于构建椎间盘退变模型较为实用、可行的动物。3.2手术方式的责任分析模型椎间盘退变是一个进行性改变的过程,在人群中发生率极高,DDD引发的腰腿痛降低了生活质量,并由此增加大量的医疗费用支出。国内外学者对椎间盘的退变过程进行了大量研究,但目前对其机制尚不完全清楚。大多数学者认为椎间盘退变是由老龄化、遗传易感性、生物力学环境及椎间盘营养等多种因素共同作用的结果,其组织学和分子生物学基础为椎间盘内活性细胞的减少和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)成分的变性、丢失。髓核内的主要ECM成分为Ⅱ型胶原和蛋白多糖,后者主要为s-GAG。Ⅱ型胶原能承受较高的压应力,而s-GAG可结合水分,对维持椎间盘黏弹性有重要作用。以上ECM成分丢失、变性会导致椎间盘内水分含量下降,生物力学性能改变,黏弹性下降,进而在反复的应力作用下碎裂、塌陷、变扁。本研究中,A~D组的生化指标和影像学检查结果均显示,损伤后的椎间盘内s-GAG和水含量均随时间延长呈下降趋势,同时伴有椎间隙高度和椎间盘MRI信号的进行性改变,以及软骨下骨质的硬化。上述改变趋势与一般椎间盘退变过程类似,表明不同的手术损伤方式均能达到成功建立椎间盘退变模型的目的。我们发现不同手术直接损伤退变模型分别具有以下特征:(1)纤维环穿刺法诱发的椎间盘退变过程出现相对较晚,多在造模手术后4~8周才开始出现相应的影像学改变和水、s-GAG含量的明显变化,其进展速度较为缓慢;退变程度与穿刺针头大小有一定相关性,这一结果与Masuda等和Sobajima等的研究结果相似。(2)终板破坏和髓核抽吸法诱发的椎间盘退变过程出现相对较早,进展较快,且退变程度较重。虽然本研究中3种方法都是通过损伤来诱发椎间盘退变,但其具体机制不完全相同。有研究显示损伤后椎间盘出现退变的机制可能与炎性反应有关。由于正常椎间盘髓核处于软骨终板和纤维环的密封之中,在个体生长发育过程中未接触机体免疫系统,因此无法获得天然免疫耐受。当椎间盘外层纤维环破损后,髓核组织接触到免疫细胞,引发自身免疫反应,导致髓核细胞发生凋亡,ECM得不到细胞分泌补充而变性丢失,最终导致退变。还有研究认为,椎间盘破损会导致其内生物力学环境发生改变,改变后的力学环境不利于髓核细胞生存,最终诱发退变。因此,理论上任何能够直达髓核的损伤均可导致椎间盘退变。髓核抽吸的方法除了上述机制外,其抽吸过程还会直接使椎间盘丢失部分髓核细胞和ECM成分,从而进一步加速退变进