1株克氏原螯虾细菌分离株的分离鉴定及抑菌活性研究

1株克氏原螯虾细菌分离株的分离鉴定及抑菌活性研究

1材料和方法1.1药敏纸片的制备生病克氏原虾来自湖北省潜江市的一个农场。作者所在实验室的临床试验基地已购买药品敏洁纸。杭州微生物试剂有限公司购买脑心提取物和mh培养基，青岛海博生物科技有限公司购买天然化合物。从四川维奇公司购买天然化合物。从pcr批评器、细菌基因提取试剂盒和其他生物学试剂，购买南京诺威赞公司。1.2动物细胞培养取患病克氏原螯虾,在无菌工作台中用无菌生理盐水冲洗体表3～5次后剖取其肝胰腺。肝胰腺经无菌生理盐水冲洗后在匀浆器中匀浆,取匀浆液在脑心浸液(BHI)固体培养基上划线,28℃培养箱中静置培养16～20h。从长好细菌的平板挑取单菌落继续划线2～3次对细菌进行纯化,纯化好的细菌标记为QJ20190513,并制备甘油菌保存于-80℃。1.3回归感染试验QJ20190513分离株单菌落在BHI液体培养基培养至对数生长中期后采用麦氏比浊法将菌液浓度调整至1.5×101.4生化鉴定试剂条首先取单菌落进行革兰氏染色后镜检,观察分离株的形态特征。此外,采用API20E生化鉴定试剂条进行生化鉴定。参照试剂条说明书,从平板上挑取菌落用无菌生理盐水稀释至合适浓度后加入试剂条各个孔中,在28℃条件下继续培养24h后判定结果。1.5pcr扩增及测序参照试剂盒说明书提取QJ20190513分离株的全基因组,以其为模板通过PCR的方法扩增分离株16SrRNA片段,PCR上游引物(16SrRNA-F):5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′,下游引物(16SrRNA-R):5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增后得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后取目的条带进行凝胶回收并测序。将测序结果用Blast软件分析同源性并采用MEGA5.1软件以邻接法构建进化树,校正模型为Kimura2-parameter,通过Bootstraps法自举数集1000次。1.6离心收集菌体从BHI平板上挑取QJ20190513分离株的单菌落至BHI液体培养基中,28℃培养至对数生长中期,离心收集菌体。菌体经无菌生理盐水洗涤3次后采用麦氏比浊法将菌液浓度调整为1.5×101.7联合感染试验采用棋盘法研究多西环素和10种不同天然化合物联合后对QJ20190513分离株的联合抑菌作用2结果与分析2.1革兰氏染色及显微镜检从患病克氏原螯虾肝胰腺纯化的优势菌在BHI固体培养基上形成白色半透明的光滑菌落,革兰氏染色后经显微镜镜检发现该菌株为革兰氏阴性短杆状细菌。2.2感染虾的死亡情况将QJ20190513分离株以注射方式感染健康的克氏原螯虾,发现感染后的克氏原螯虾出现了活力下降等症状,且感染虾出现了不同程度的死亡,死亡率与感染剂量呈正相关,在感染试验过程中阴性对照组未出现发病和死亡情况(表1)。进一步剖检发现,感染后的克氏原螯虾肝胰腺发白甚至水肿,肌肉发白。此外,从症状明显的感染虾肝胰腺中分离到了1株优势菌,其培养特性与分离株QJ20190513基本一致。经Bliss法计算得到该菌株对克氏原螯虾的半数致死浓度LC2.3生化特征分析采用API20E细菌鉴定试纸条和ATB细菌鉴定系统分析了分离株QJ20190513的生化特征,结果如表2所示。经ATB系统判定该菌株的生化特征与系统中摩氏摩根菌的特征相符合,其相似度为99.9%。2.4摩氏犯罪菌株与摩氏犯罪的序列比对通过PCR方法得到了分离株QJ20190513的16SrRNA片段,其长度约为1.5kb。将测序结果提交至Blast软件与GenBank中已知序列比对发现,该菌株与摩氏摩根菌的同源性大于99%。通过MEGA软件构建发育树(图1)发现,分离株QJ20190513(MT890001)与摩氏摩根菌(AY464464.1)亲缘关系较近,结合该菌株的生理生化特征将QJ20190513菌株鉴定为摩氏摩根菌。2.5种化学药物的敏感性采用K-B法检测了QJ20190513分离株对20种化学药物的敏感性,结果发现,分离株对妥布霉素、新霉素、亚胺培南等7种药物敏感,对卡那霉素中度敏感,对庆大霉素、链霉素、头孢唑啉等12种药物耐药(表3)。2.6不同植物基质酚对菌株生长的影响从表3可见,QJ20190513菌株对多西环素不敏感,多西环素对QJ20190513菌株的最小抑菌浓度为64μg/mL(表4)。受试天然化合物血根碱、和厚朴酚、二氢辣椒碱和异土木香内酯对菌株QJ20190513的生长均有一定的抑制作用,其MIC分别为16、64、32和64μg/mL(表4)。而当多西环素与天然化合物联合使用后仅二氢辣椒碱与多西环素具有协同抑制QJ20190513菌株的作用,其FICI为0.19,联合使用后多西环素MIC下降了16倍,二氢辣椒碱MIC下降了8倍。3细菌致病性增加克氏原螯虾对环境适应能力较强,可在低氧、多种水温和水质环境差的地方生存,是近年来具有较高经济价值的养殖品种之一摩氏摩根菌是人类肠道中的正常菌群之一,通常不会导致人类疾病,但在特殊条件下能导致免疫力低下的人发生感染,在人类医学上是一种少见的条件性致病菌化