荧光光谱分析方法及原理课件

参考书赵南明，周海梦.生物物理学，高等教育出版社，2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde,W.C.JohnsonandP.S.Hoeds.PrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall,1998参考书赵南明，周海梦.生物物理学，高等教育出版社，20001

某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物

萤石(fluospar)而得名。 我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。 除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。 某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出2

Indiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmolecule.

Inmanycasesthesequelisnotveryinteresting;theenergyistransferredasheattothesurroundings.

Insomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescence.

Wewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptions.Indiscussingabsorptionweh3荧光光谱的特点荧光光谱的特点4BarakandWebbdemonstratedthatasfewas30fluorescentdyemoleculesboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicine.

FluorescenceisasensitivetechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedth5荧光光谱灵敏度高的原因

荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同； 荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测； 这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，且测量方法简便。荧光光谱灵敏度高的原因 荧光辐射的波长比激发光波长长，测6荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的10-15秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外可见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。

荧光光谱第二个特点是信息量较大荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、7基本原理基本原理8Fluorescence

Fluorescenceisemissionfromasingletstate,wheretheelectronspinsinthemoleculearepaired.

FluorescenceFluorescenceise9Fluorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstate.duringthishesitationoneofthreethingsmayhappen:themoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossing)itmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransition).Fluorescenceexcitationbyabso10EMISSlONLlFETlMESEmissionlifetimesofabsorption,fluorescence,andphosphorescenceattheequilibriuminternucleardistanceofthegroundstate.EMISSlONLlFETlMESEmissionlif11仪器结构仪器结构12FLUORESCENCEINSTRUMENTATlONDiagramofasimplefluorescenceinstrumentFLUORESCENCEINSTRUMENTATlONDi13FilterFluorometersInstrumentsinwhichwavelengthselectionisaccomplishedwithfiltersaregenerallyreferredtoasfluorometers,whereasmonochromator-basedinstrumentscapableofspectralscanningarecalledspectrofluorometers.Thesimplest,leastexpensive,fluorometersaresinglebeamfilterinstrumentswithhalogenlampsources,phototubeorPMTdetectorsandsimpleoutputdevices.Ratiometricfluorometersarealsoavailableinwhichtheratioofthesamplesignaltoareferencesignalisusedinordertocompensateforfluctuationsinfinevoltage,drift,etc.

FilterFluorometers14Insomeinstruments,suchastheoneshowninfigure,thesampleandreferencelightpathsaretakenfromthesamesourceandalternatelymeasuredbythesamedetectorthroughtheuseofamechanicalcam.Asimilarconfigurationinwhichtwodetectorsareused,oneforthesamplebeamandoneforthereferencebeam,willcorrectforsourceoutputfluctuationsonly.Singledetectorconfigurationsarealsopossibletominimizeeffectsofdetectorvariability.

Insomeinstruments,suchast15Schematicdiagramofadouble-beam(ratiometric)filterfluorometer.

Schematicdiagramofadouble-16Filterfluorometersaresuitableforquantitativeanalysisapplicationsinwhichspectralscanningandhighresolutionarenotrequired.Filterstransmitmorelightandcostlessthanmonochromators,therebyprovidingbetterdetectionlimitswithlessexpensiveinstrumentation.Filterfluorometersaresuitab17Spectrofluorometers

Spectrofluorometersarealsoavailableinbothsinglebeamandratiometricconfigurations.AsinglebeaminstrumentisshowninFigure8.AratiometricspectrofluorometcrconfigurationinwhichtwoseparatedetectorsareemployedisdepictedinFigure9.ThereferencePMTmonitorstheexcitationbeamafterithaspassedthroughthemonochromatorsothatcorrectionsarebasedonfluctuationsinthewavelengthofinterestonly.ThereferencePMTisplacedafterthesampletomonitorthetransmittedbeam,therebyallowingabsorptionmeasurementstobemadeonthesample.Spectrofluorometers18Figure8Schematicdiagramofasingle-beamspectrofluorometer.FromPerkin-Elmer.

Figure8Schematicdiagram19Figure9.Schematicdiagramofaratiometricspectrofluorometer.

Figure9.Schematicdiagram20Singlephotoncountinginstrumentsareusedtomeasureverylowlightlevelsandaredesignedformaximumsignal-to-noiseperformance.

Figure10.Depictionofsinglephotoncounting.ThesignalisdetectedbythePMT,emergingasapulsewhichisthenamplified.Ifthemagnitudeoftheamplifiedpulseexceedsacertainthreshold,itispassedthroughthediscriminatorandcountedasasignal.Smallerpulsesduetonoiseanddarkcurrentaremuchmorelikelytoberejected,therebyincreasingsignal-to-noise.

Singlephotoncountinginstrum21Spectrofluorometersofferthemostflexibilityforquantitativeandqualitativeapplications.Manyinstrumentsaremodularsothatmonochromatorscanbereplacedwithfiltersintheemissionorexcitationbeamsifdesired.Spectrofluorometersofferthe22主要譜参量主要譜参量23激发谱和发射谱

荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

激发谱和发射谱24既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关关系。激发谱和吸收谱的关系既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的25由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。

吸收谱与发射谱的关系由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能26在发射谱中最大荧光强度的位置称为

max，它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感。

在发射谱中最大荧光强度的位置称为max，它是荧光光谱的一个27荧光寿命(fluorescencelifetime)

去掉激发光后，分子的荧光强度降到去掉激发光时荧光强度I0的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用

表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律:It

I0e-kt其中I0是激发时最大荧光强度，It是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时间时测得的It为I0的1/e，则是我们定义的荧光寿命。荧光寿命(fluorescencelifetime)28寿命

是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需的时间都应等于。

寿命是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧29如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比，荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数，因此有

F

1/KF。KF是发射速率衰减常数。

F表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射速率的衰减常数。如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发30处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程(如淬灭和能量转移)回到基态，其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)，结果是荧光寿命降低。寿命

和这些过程的速率常数有关，总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:k

kF+kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命

为:

1/k

1/(kF+ki)处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些31由于吸收几率与发射几率有关，F与摩尔消光系数max(单位为cm2mol-1或(moldm-3)-1cm-1)也密切相关。从下式可以得到

F的粗略估计值(单位为秒)。1/F≈104

max在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。由于吸收几率与发射几率有关，F与摩尔消光系数max(32量子产率(quantumyield)

荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的效率。荧光量子产率通常用

来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。

发射量子数

吸收量子数

量子产率(quantumyield)33

的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。后面将要证明:对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比:FkI0A

这里k是比例常数，I0是吸收前的光强度，

是荧光量子产率。若两种溶液测量条件完全相同，则它们的k和I0相同:F1/F2

A1

1/(A2

2)

1/

2

F1A2/(F2A1)已知2就可求出1。的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修34FluorophoresarecomparedusingtheratiooftheirfluorescenceyieldsOftenfluorophoresarecomparedusingtheratiooftheirfluorescenceyields.AsweseeinFigure11.13,thisrelativefluorescenceyieldwilldependonthewavelengthchosenforobservationbecauseoftheshapesofthefluorescencespectra.Figure11.13Therelativefluorescenceyieldisdefinedforasinglewavelengthanddependsonthewavelengthchosenforobservation.Fluorophoresarecomparedusin35由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭、杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果只需要研究量子产率的相对值，则只要量测荧光强度也就足够了。由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(que36荧光强度荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与量子产率

的乘积。这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强度ＦIA

Z，这里Z是仪器因子。椐据Beer-Lambert定律可以推得：Fλ=2.3I0

(

A)C·L·

·Z式中

(

A)为激发波长A处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，L为光程（样品池光径）荧光强度37如果激发光强保持不变，且和Z与激发波长无关，则F

(

A)很显然，荧光强度与样品在波度A处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。荧光光谱分析方法及原理课件38荧光偏振（偏振荧光，极化荧光）

用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，可以产生极化荧光。可以通过对极化荧光的分析确定分子的大小、形状和流动性等性质。因此极化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段。

荧光偏振39荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质。溶液中分子偶极矩方向的分布是随机的，为什么用偏振光激发时产生的荧光是偏振光呢？从经典物理的观点来看，电子的跃迁相应于一个电偶极子的振动，其振动方向和电场变化方向一致时被激发发的几率最大，并随两者间夹角余弦的平方（COS2

）而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子方向垂直的方向上最强（即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的荧光最强），在与电偶极子平行的方向上最弱。荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质。40溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸收到发射的时间之内，分子本身已经产生了转动，因此荧光偏振的程度将减小，所以荧光偏振又常称为荧光消偏振或荧光去偏振。在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中，Ｐ的值称为本征极化率P0。如果分子在激发态的寿命期间有一定的运动，则Ｐ的值可能与P0不等。溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸收到发射的时间之内，分41T-formatforpolarizationmeasurements.DET,detector;G,gain.Subscriptsrefertohorizontal(H),vertical(V),perpendicular(

)andparallel(

).

图荧光偏振测量如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点，在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在y轴收集极化荧光，令I‖为沿ｚ轴振动的极化荧光，令I

为沿ｘ轴振动的极化荧光。

T-formatforpolarizationmeas42如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点，在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在y轴收集极化荧光，令I‖为沿ｚ轴振动的极化荧光，令I

为沿ｘ轴振动的极化荧光。定义极化率(或偏振度)P(I‖－I

)/(I‖+I

)

(IVV－IVH)/(IVV+IVH)下标中的前、后两个字母分别表示入射光和发射光的偏振方向，V(vertical)表示垂直，H(horizontal)表示水平，如其中IVH是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度，其它如IVV也依此类推。如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点，在原点有43由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正因子G，定义G为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，为G

IHV/IHH

IHV为起偏器水平取向而检偏器垂直取向时测得的荧光强度，IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度。仪器不同，波长不同，Ｇ值都可能不同，应分别测定。经校正后的荧光偏振度Ｐ(IVV

GIVH)/(IVV+GIVH)由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能44定义不对称度(或荧光各向异性，anisotropyfactor)A

(I‖

I

)/(I‖+2I

)(I‖+2I

)表示发射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。

经校正后的不对称度A(IVV

GIVH)/(IVV+2GIVH)定义不对称度(或荧光各向异性，anisotropyfact45Additivitypropertiesofpolarization

theaverageanisotropymeasuredforamixtureofcomponentsisjustthesumoftheindividualanisotropiesweighedbytheirfluorescenceyieldF,(11.14)Additivitypropertiesofpolar46P和A的量测有时在稳态条件下进行，即采用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的偏振光脉冲来测量I‖和I

的时间函数。这种技术常能测到一些其他的运动，是一种时间分辨的技术。

P和A的量测有时在稳态条件下进行，即采用恒定的光照。但有时也47环境对荧光参数的影响环境对荧光参数的影响48荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2－3个数量级。但正因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如样品的温度度、pH值以及样品中杂质的存在等等。有时，为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑和设法减少这些因素的影响；有时，也可巧妙地利用荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。下面，我们将分别列举一些环境因素对max、

F和F等荧光参数的影响。荧光光谱分析方法及原理课件49SolventeffectsSolventeffectswillaffectthepositionofthefluorescenceband.Theeffectsofasolventonfluorescencecanbeverylarge,andmanystudiesofmacromoleculesusethisfact.

Generalsolventeffectsdependonthepolarizabilityofthesolvent,andincreasingthedielectricconstantusuallyshiftsthefluorescencetolongerwavelength.Specificsolventeffectsaretheresultofchemicalreactionoftheexcitedstatewiththesolvent.Importantchemicalreactionsinclude:hydrogen-bondingacid-basechemistrytheformationofcharge-transfercomplexeswhereanelectroninthefluorophoreistransferredtoanothergrouponexcitation.SolventeffectsSolventeffects50GeneralsolventeffectsGeneralsolventeffectsinvolvetheinteractionofthepermanentdipolemomentofthemoleculeinboththegroundandexcitedstateswiththereactivefieldinducedinthesurroundingsolvent.Thereactivefieldhastwoparts:theimmediatereactionoftheelectronsofthesolventmoleculestheslowerreorientationreactionofthesolventmoleculesasawholeduetotheirownpermanentdipolemoment.

GeneralsolventeffectsGeneral51溶剂影响的结果可以用Lippert方程来描述：

＋常数

其中，

a与f分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，a

f反映了吸收光与发射光能量的差别；为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂中的半径，与

分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。溶剂影响的结果可以用Lippert方程来描述：52由上式可见，介电常数增加会使能量差增大，而折射率增加使能量差减少。由于荧光分子激发态的偶极矩

一般要大于基态偶极矩

，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数

不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，上式中第一项()/(2

)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，

n2，a

f很小。而在极性溶剂中

a

f较大，产生红移。由上式可见，介电常数增加会使能量差增大，而折射率增加使能量差53SpecificsolventeffectsTheyoftenaccompanygeneralsolventeffects,becausesolventswithalargepolarizabilityareusuallycapableofhydrogenbonding.Specificsolventeffectsoccurwhenthesolventreactschemicallywiththefluorophore.Onlyasmallconcentrationofthechemicallyreactingsolventisnecessarytobringtheeffecttocompletion.Thenewspeciesoftenhasanewcharacteristicfluorescentband.SpecificsolventeffectsTheyo54Traceamountsofethanoladdedtoacyclohexanebulksolventgiverisetoanewfluorescentbandatabout400nm,whichispresumablyduetothe2-AN-ethanolhydrogen-bondedcomplex.

Thehydrogenbondingreactionof2-ANwithethanol

Thefluorescenceof2-ANisshownincyclohexanetowhichethanolwasaddedat0%(

),0.2%(...),0.4%(

),0.7%(

),l.7%(

),and2.7%(

).Traceamountsofethanoladded55环境因素对

max的影响

一般来说，处于第一电子激发态的分子，其电荷分布与它处于基态时是不同的。生色团与周围溶剂分子的相互作用可能会先于发射而发生，这种相互作用会改变激发态的能量及荧光发射的频率。引起每个电子能级中最低振动能级之间的吸收和发射跃迁（即0-0跃迁）的不平衡，并会破坏镜象关系。

环境因素对max的影响56同一种荧光物质在不同极性的环境中，其

max可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移。例如，当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙醇到辛醇依次减小时，ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生兰移，量子产率提高。

环境(如溶剂)的极性对

max的影响同一种荧光物质在不同极性的环境中，其max可能会有所差别57

上面提到的“环境极性加强，

max红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生max兰移的情况。这种现象称为“orientationconstraint”。因此在利用max作为环境极性的探针时要十分谨慎。

上面提到的“环境极性加强，max红移”的规律，并不58pH值对

max的影响如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对max有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光max也可能发生变化。例如，1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指示剂。

pH值对max的影响59溶液粘度对

max的影响溶液粘度有时也会对max有影响，例如荧光探针TNS在蔗糖水溶液中的max会随蔗糖浓度的变化而变化。当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，max从580nm兰移到555nm。

溶液粘度对max的影响60共振能量转移对

max的影响如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对max可能造成影响。

共振能量转移对max的影响61环境对荧光量子产率

F和荧光强度的影响由于稀溶液中荧光强度F

KI0AF（这里I0是激发光强度，A是光密度或吸收度，

0是荧光量子产率，K为常数），因此凡是会影响荧光量子产率

F的环境因素也必然会影响荧光强度。

环境对荧光量子产率F和62溶剂（或环境）极性的影响量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。这一点前面已经提到过。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。

溶剂（或环境）极性的影响63光化分解荧光物质因吸收光能而造成某一键断裂的现象称为光化分解（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。

光化分解64温度对荧光强度的影响一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升高与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。温度每升高1

C，荧光减弱的百分数称为温度系数。一般荧光物质的温度系数大约为1%，但有些荧光物质可大到5%。

温度对荧光强度的影响65温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭、量子产率降低的情况。如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。为减少温度对荧光强度的影响，可采用恒温样品架维持样品温度的恒定。

温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶66样品浓度对荧光强度的影响在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。这是因为：

样品浓度对荧光强度的影响67荧光强度F

K

I0(1e

lc)，这里K是仪器常数，

是量子产率，I0是激发光强度，

是克分子消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。浓度增加到一定程度后，e

lc接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。只有样品浓度很稀时，FKI0

[1

(1

lc)]KI0

lC

荧光强度FKI0(1el68II.荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。对于浓度淬灭产生的原因最简单的解释是：激发态分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自淬灭。

II.荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。这样就使荧光强度反69III.浓度过高，可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。

III.浓度过高，可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降70产生浓度淬灭的另一个重要原因之一是：当溶液较浓时，激发光一进入溶液，就被靠近光源一侧的样品池壁的荧光分子大量吸收，这样，越进入溶液，发荧光分子越少，因而大量的激发光在到达池中心之前就被吸收了。这样，样品池中心区域内能被激发的荧光分子数量就很有限了。即使是样品池中心区域内能被激发的荧光分子，它们发出的荧光又可能被它们与检测器之间的荧光分子吸收（如果物质本身的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），这样，大部分荧光分子发射的荧光在离开吸收池前就又被吸收。

产生浓度淬灭的另一个重要原因之一是：当溶液较浓时，激发光一进71解决浓度淬灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料浓度成范围线性关系的浓度来测量。浓度淬灭的现象有时也可以加以利用，例如在脂质体里包裹高浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。一旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。

解决浓度淬灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料72杂质对量子产率（荧光强度）的影响除荧光分子之外的其它分子与荧光分子的相互作用使荧光量子产率减少的现象统称为杂质淬灭。会引起荧光淬来的物质称为淬灭剂。例如中性的0.1M磷酸缓冲液能淬灭酪氨酸的荧光。

杂质对量子产率73杂质淬灭的几种形式Ⅰ.碰撞淬灭：溶液中荧光分子与淬灭剂分子碰撞，荧光分子损失能量而导致量子产率减少，荧光强度降低。Ⅱ.组成化合物导致荧光淬灭：一部分荧光分子与淬灭剂分子作用而形成络合物。这种络合物本身可能不发荧光，也可能会具有吸收激发光能或荧光物质所发射的荧光光能的能力，从而减少观察到的荧光（内滤光效应）。

杂质淬灭的几种形式74Ⅲ.含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物容易由单线态转变至三线态。转入三线态的分子在常温下不发光，它们把多余的能量消耗在与其它分子的碰撞中，引起荧光淬灭。只有在低温下，由三线态返回基态而放出波长的磷光。

Ⅲ.含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、75Ⅳ.发生电子转移反应的淬灭。某些淬灭剂分子与荧光物质分子相互作用时会发生电子转移反应，即氧化

还原反应，从而引起荧光淬灭。甲基兰荧光溶液被Fe

2淬灭就是一个例子。发生电子转移反应的淬灭剂并不限于金属离子。I

、Br

等易于给出电子的阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生淬灭作用。

Ⅳ.发生电子转移反应的淬灭。76引起淬灭的一种最常见的物质是处于三线态的活性氧。产生淬灭的原因主要是由于处于三线态的活性氧分子与单线态的荧光分子相互作用时会形成单线态的氧分子和三线态的荧光分子。氧在弱极性溶剂中的溶解度比较高，例如氧在乙烷中的溶解度约为在水中的几倍。因此必须通氮赶氧，克服这种淬灭。

引起淬灭的一种最常见的物质是处于三线态的活性氧。产生淬灭的原77Ⅴ.共振能量转移：（略）

Ⅴ.共振能量转移：（略）78总的来说，为克服杂质淬灭带来的问题，对所使用的溶剂或缓冲液，首先要考虑其对所使用的荧光物质是否有直接作用。另外必须考虑溶剂的纯度。如洗液中的重铬酸钾，其两个吸收峰恰好在色氨酸的激发和发射峰附近，会吸收色氨酸的激发能及其发射的荧光（内滤光效应）因此荧光器皿不能用洗液来洗。

总的来说，为克服杂质淬灭带来的问题，对所使用的溶剂或缓冲液，79pH值对量子产率和荧光强度的影响如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。利用这些物质对pH值的敏感性，可以将它们用作pH指示剂，或利用它们在不同pH值溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的终点（特别是在有色或混浊的溶液中）。pH值对量子产率和荧光强度的影响的另一个例子是，pH10.9时，色氨酸量子产率最高，为0.51；pH在4－8之间，量子产率为0.2；pH小于4时，量子产率只有0.085。pH值对量子产率和荧光强度的影响80溶液粘度对荧光强度的影响荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。例如荧光物质TNS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随粘度增加而增加。

溶液粘度对荧光强度的影响81荧光光谱分析方法及原理课件82其它各种干扰因素一些其它的干扰因素可能影响荧光强度：光散射可能影响荧光强度。区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远；荧光污染也是影响荧光强度的一种因素：洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光；分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光；溶液中微生物的产生；滤纸中的杂质；表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影响。

其它各种干扰因素83环境因素对荧光寿命的影响环境因素对荧光寿命的影响84碰撞淬灭前面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭也可能使荧光寿命缩短。例如前面提到的0.1M磷酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从3.4ns缩短到2.6ns。

碰撞淬灭85浓度与荧光寿命的关系荧光生色团的浓度增加，荧光量子产率下降，但荧光寿命不一定减少，一些荧光染料的荧光寿命反而随浓度的增加而延长。这种现象不是由于二聚体的形成，而是由于自吸收。特别是当吸收光谱与荧光光谱有较大重叠时，重叠区的荧光发射后，再一次被吸收，经历了二次激发或多次激发，测量到的表观寿命就会延长。

浓度与荧光寿命的关系86分子内环境与荧光寿命生色团在分子内的环境也会影响荧光寿命，正是由于这个原因，荧光寿命才被用来分析分子内不同的生色团所处的环境。当然，严格地说，分子内环境和外环境是两个不同的概念。分子内环境与荧光寿命87除上述可能影响荧光寿命的因素之外，实际中要注意的是，不同测量方法测出的寿命也会有一定差别。因此研究荧光寿命时，相同方法和相同条件测量出来的寿命才有可比性除上述可能影响荧光寿命的因素之外，实际中要注意的是，不同测量88环境对荧光偏振度的影响

温度对荧光偏振度P的影响温度对荧光偏振度P的影响：一般来说，温度升高，荧光偏振度会下降。

粘度对荧光偏振度的影响随着粘度的提高，荧光偏振度也会上升。

环境对荧光偏振度的影响89荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中的应用90天然荧光生色团和荧光探针(Naturalfluorophoresandfluorescentprobes)天然荧光生色团和荧光探针(Naturalfluoropho91Fluorescentmoleculesareoftenreferredtoasfluorophores.Fluorescentmoleculesareofte92判断荧光生色团的标准判断化合物能否产生荧光，可以从以下几个方面来分析：碳原子骨架：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。任何有利于

电子共轭度的结构变化都将提高荧光效率。分子的几何排布：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。取代基的类型和位置。环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。判断荧光生色团的标准判断化合物能否产生荧光，可以从以下几93生物化学中主要的荧光生色团生物化学中主要的荧光生色团可分为两类:天然荧光生色团荧光指示剂（荧光探针）生物化学中主要的荧光生色团生物化学中主要的荧光生色团可分为两94主要的天然荧光生色团蛋白质中的芳香族氨基酸核黄素、维生素A、叶绿素等天然色素和NADH等少数分子核酸中tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）主要的天然荧光生色团蛋白质中的芳香族氨基酸95蛋白质和核酸中的荧光生色团蛋白质和核酸中的荧光生色团96在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。这一方面是由于色氨酸的吸收度和量子产率较高，另一方面是由于在色氨酸存在的条件下，酪氨酸吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给色氨酸，由色氨酸发出荧光。在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。这一方97荧光探针总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。荧光探针总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度98对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求：能产生稳定的，较强的荧光。探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固。探针的荧光必须对环境条件较敏感。结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求：99TypicalfluorescentprobesTypicalfluorescentprobes100Structuresof

somefluorescentprobesStructuresof

somefluorescen101参考文献ALANWAGGONER,CovalentLabelingofProteinsandNucleicAcidswithFluorophores,inMETHODSINENZYMOLOGY.VOL246,p362-373参考文献ALANWAGGONER,CovalentLa102天然色素的内源荧光分析

维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。例如，可用345nm激发，490nm处测量，用以确定血液中维生素A的含量。核黄素即维生素B2在pH7.0时，用激发波长370nm（或440nm），发射波长为565nm检测，可以确定组织中核黄素的总量。维生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激发，305nm处检测。维生素C用490nm激发，可产生绿色荧光（530nm）。天然色素的内源荧光分析维生素大多含有芳香环结构，本103植物、藻类或光合细菌中含有各种色素和辅助色素分子，包括叶绿素a、b、c1、c2，类胡萝卜素如

-胡萝卜素、岩藻黄质、多甲藻黄素，藻胆素如藻蓝素、藻红素等，都含有荧光生色团，它们的荧光激发谱和荧光发射谱都可用来鉴定色素的存在及含量，也可以用来分析光合作用过程中能量的吸收与传递。植物、藻类或光合细菌中含有各种色素和辅助色素分子，包括叶绿素104荧光光谱分析方法及原理课件105用荧光光谱测量光合效率用荧光光谱测量光合效率106光合系统中色素内源荧光是研究光合作用的一个非常重要的信息来源，荧光光谱仪因而也就成了植物生理学家的“听诊器”，一些专用的荧光仪可以方便地携带到田间直接测量作物叶片的光合效率。光合系统中的天线色素如叶绿素吸收太阳光的光能后被激发到能量较高的激发态，然后会以各种形式耗散其吸收的能量，弛豫回到基态。这些能量耗散的形式包括将能量传递到光合反应中心，进而进行光化学反应，也包括荧光发射。如果反应中心的光化学反应由于某种原因受阻，则荧光产率会增高。换句话说，荧光越强，光化学速率越低，荧光越弱，光合效率越高。因此，可以利用荧光强度的变化估算出光合效率的高低。光合系统中色素内源荧光是研究光合作用的一个非常重要的信息来源107荧光光谱分析方法及原理课件108ApplicationsofFluorescentProbesNucleicAcidDetectionPeptideandProteinDetection,AnalysisandSynthesisEnzymesandEnzymeSubstratesProbesforActin,TubulinandNucleotide-BindingProteinsProbesforOrganellesProbesforLipidsandMembranesFluorescentTracersofCellMorphologyandFluidFlowAssaysforCellViability,ProliferationandFunctionProbesforEndocytosis,ReceptorsandIonChannelsPhotoactivatable(Caged)ProbesProbesforSignalTransductionProbesforReactiveOxygenSpecies,IncludingNitricOxideIndicatorsforCa(2+),Mg(2+),Zn(2+)andOtherMetalspHIndicatorsIndicatorsforNa(+),K(+),Cl(-)andOtherAnionsProbesforMembranePotentialApplicationsofFluorescentPr109FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNSFluorescencehasprovedtobeaparticularlyvaluabletechniqueforstudyingproteins.Usethefluorescenceofproteinstoillustrate:analyticaldetectionchangesinquantumyieldtheeffectsofenergytransferchangesinfluorescencepolarizationwithtimethatcanbeusedtomonitorshapestudythestoichiometryofcomplexformationobservethepresenceofintermediatesdetermineequilibriumconstantsascertainthemicroenvironmentofbindingsites.

FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl110FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS1.AnalyticaldetectionFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl111ANALYTlCALAPPLlCATIONS

FluorescenceintensityFisusefultobiochemistsinobservingthepresenceofamacromolecule.

ANALYTlCALAPPLlCATIONSFluo112Forinstance,biopolymersemergingfromahighpressureliquidchromatograph(HPLC)mightbemonitoredwithafluorescencedetector.WeseeinFigure11.6atheresultsfortheisolationoftheproteinmelittinfromhoneybeevenomonanHPLC.Melittinhasatryptophanresiduethatcanbeexcitedat280nmtofluoresceoverarangeofwavelengthsthatinclude340nm.TwoproteinsareelutedfromtheHPLCthathave340nmfluorescence,oneat5.9minandoneat11.7min.Thefractionat11.7minhasmelittinactivity(hemolysisofredbloodcells).MonitoringtheelutionwithnormalUVabsorbanceat214nm(Figure11.6b)revealsanumberofotherfractionsthatcontainbiologicalmolecules,butthesedonothavetobeconsideredbecausetheydonotfluoresce.Byusingfluorescenceforanalysis,identificationoftheproperfractionissimplified.

Figure11.6Thefluorescence(a)andelectronicabsorption(b)foramelittinpreparationemergingfromahighpressureliquidchromatograph.Themelittinelutesat11.7min.Forinstance,biopolymersemer113FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS2.ChangesinquantumyieldFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl114QuantumyieldisausefulquantityQuantumyieldisausefulquantityChangesinthequantumyieldareoftendiagnosticofchangesinthemolecularenvironmentofachromophoreForexample,thequantumyieldofafluorophorewilloftenincreasewhenthemoleculeistakenupfromsolutionandboundtoamacromoleculesuchasDNAoraprotein.Measurementofthequantumyieldprovidesasimplewaytomeasurebinding.Quantumyieldisausefulquan115利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的结构变化氨基酰化酶在十二烷基硫酸锂作用下内源荧光发射谱随作用时间的变化,随作用时间的增加，荧光强度逐渐减小。表明随作用时间的增加，该蛋白质逐渐变性，发生去折叠，蛋白质内部的荧光生色团逐渐暴露在极性水环境中。Changesinthefluorescenceemissionspectraofaminoacylaseduringdenaturationin0.6mMLDS.Repeatedscanofthefluorescenceemissionspectrawithanexcitationwavelengthof295nmaftermixingtheenzymewithLDSsolution.Thefinalconcentrationoftheenzymewas0.37

M.Reactiontimesoftheenzymedenaturaionforcurvesfromtoptobottomwere0,1,3,5,8,10,15,20,25,30,40and50min,respectively.利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的结构变化氨基酰化酶在十二116FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS3.TheeffectsofenergytransferFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl117共振能量转移参考文献1.PAULR.SELVIN,FluorescenceResonanceEnergyTransfer,in“METHODSINENZYMOLOGY.”VOL246,p300-3342,3,4见所提供的阅读文献共振能量转移参考文献118Energytransfer

Underfavorablecircumstancesexcitationenergycanbetransferredfromonefluorophoretoanother:TransitiondipoleinteractionbetweenthetwofluorophoresAnappreciableoverlapofthefluorescencespectrumofthedonorwiththeabsorptionspectrumoftheacceptorTherequirementofdipole-dipoleinteractionbetweenthefluorophoresleadstoastrongdependenceofenergytransferonthedistancebetweentheparticipatinggroups

EnergytransferUnderfavora119如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射谱与另一种生色团的激发谱有相当程度的重叠。则当第一种荧光团被激发时，另一种荧光团却因第一种生色团激发能的转移而被激发，这种现象称为共振能量转移。

共振能量转移如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射120DependenceofefficiencyofenergytransferonthesixthpoweroftheseparationrFigure11.14Theefficiencyofenergytransferchangesrapidlywiththedistancebetweendonorandacceptor.Dependenceofefficiencyofen121EfficiencyofenergytransferTheefficiencyoftransferisgivenbyefficiency=HereR0isthedistancefor0.5efficiencyoftransfer,andischaracteristicofthedonor-acceptorpairandthemediumbetweenthem.EfficiencyofenergytransferT122R0称为临界距离，定义为能量转移效率为50%时两个生色团之间的距离，对于每个供体一受体时，R0是常数。R0可以根据受体的吸收谱和供体的发射谱、介质的折射系数、供体和受体跃迁电偶极矩的朝向因子、供体在没有受体存在时的量子产率等参数估算出来。根据转移效率和R0，即可求出两个生色团之间的距离。这种测定生色团距离的方法，常被人称为光谱尺。R0称为临界距离，定义为能量转移效率为50%时两个生色团123R0FOR