检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法VIP

专利检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法01专利背景技术领域实施方式发明内容权利要求荣誉表彰目录0305020406基本信息《检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法》是中华人民共和国北京出入境检验检疫局和深圳市匹基生物工程股份有限公司于申2005年2月28日请的发明专利，该专利的申请号为57，公布号为CN，公布日为2006年9月6日，发明人是魏传忠、张鹤晓、赖平安、杨伟、高志强、张利锋、刘环、刘继红、郭晋优、李宁、谷强、汪琳、吴丹、段生涛、张向东。《检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法》涉及检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的禽流感病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测禽流感病毒的方法，属于检验检疫领域。一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.1－No.3所示的碱基序列。该发明的有益效果为：快速、敏感、特异、灵敏、操作简单；试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。2014年11月6日，《检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法》获得第十六届中国专利优秀奖。专利背景专利背景禽流感是危害养禽业的重要传染病，是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。截至2005年2月，根据血凝素（H）和神经氨酸酶（N），可将A型流感病毒分为不同亚型，已报道的有15种血凝素HA亚型（H1～H15）和9种神经氨酸酶NA亚型（N1～N9）。禽流感病毒呈世界分布，绝大多数禽流感病毒呈隐性感染，不表现任何临床症状，只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致死性的特性，称之为高致病力禽流感病毒（HPAI）。高致病力禽流感通常是由H5和H7亚型禽流感病毒引起的，是严重危害养禽业的重大传染病之一，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病，中国也将其列为一类检疫对象。1994年，墨西哥在其中部地区发病的商品鸡群中分离出H5N2禽流感病毒；1995年，美国犹他州发生由H7N3引起的禽流感，在方圆800公里的暴发地区内，比较集中的火鸡群相互之间都受到了感染；1997年香港的养鸡场和禽类市场爆发了由H5N1引起的禽流感，并导致人的严重疾病，在全世界引起极大恐慌；1999年，意大利发生了由H7N1引起的禽流感，火鸡的死亡率很高；2001年，香港再度受到禽流感病毒H5N1的困扰。自韩国2001年从上海出口的鸭肉中检测出禽流感病毒H5亚型后，日本、欧盟等对中国出口禽肉采取严厉检疫措施，日本声称从中国出口的禽肉中多次检出高致病力禽流感病毒H9亚型，2003年4月，在中国受“非典”影响出口滑坡的情况下，日本从中国出口鸭肉中三次检出禽流感病毒H5亚型，导致封关。在中国国内疫情复杂、中国国外频频对中国出口禽肉检出问题的严峻形势下，如果不采取严格的检验检疫措施，势必影响禽肉的出口。禽流感主要依靠实验室进行确切诊断，诊断方法主包括血清学检测及病原的分离和鉴定两方面。血清学检测的对象是从禽类体内采集血液析出血清后，检测血清中抗体的有无和滴度变化。发明内容专利目的有益效果技术方案发明内容专利目的《检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法》的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列。该发明的第二个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列。该发明的第三个目的是提供一种操作简单、结果准确的用与检测禽流感病毒的试剂盒。该发明的第四个目的是提供一种快捷、准确、方便的检测禽流感病毒的方法。

技术方案禽流感病毒通用引物、探针序列：上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA探针：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA作为探针的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团（FAM）和荧光淬灭基团（TAMRA），委托美国IntegratedDNATechnologies，inc合成。选择A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计多对通用引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。进行大量筛选试验得到以上序列，该通用引物和探针序列不仅能够用来检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型，而且对其他禽流感病毒亚型也能检出，用其检测常见其他禽类病毒，未发现交叉反应。该通用引物可以在短时间内检测出样本是否感染了禽流感病毒，节约人力和物力和检测时间。有益效果1）快速：从样品处理到出结果仅需4小时左右；2）敏感：检测组织脏器和拭子的灵敏度与鸡胚病毒分离基本一致；3）特异：与常见禽类其他病毒不发生交叉反应，而且不仅采用了特异性的引物，还采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统PCR方法，杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；4）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍。对于禽流感病毒尿囊液，稀释至10-7仍可检出，接近鸡胚病毒分离；5）操作简单：试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。

技术领域技术领域《检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法》涉及检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的禽流感病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测禽流感病毒的方法，属于检验检疫领域。

权利要求权利要求1.一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.1-No.3所示的碱基序列。2.根据权利要求1所述的一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQIDNo.3的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。3.一组用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.4-SEQIDNo.6所示的碱基序列。4.根据权利要求2所述的一组用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQIDNo.6的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。5.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1-4所述的核苷酸序列作为检测禽流感病毒的引物I、引物II或探针序列。6.根据权利要求5所述的一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：其组成如下：1）裂解液；2）RT-PCR反应液，终浓度配制成：10×PCR缓冲液；1uTaqE；0.2微摩尔/升引物I；0.2微摩尔/升引物II；0.1微摩尔/升探针；0.实施方式实施方式实施例1.筛选通用引物和探针序列一.材料：涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存二.方法（一）设计合成引物和探针序列A型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，该试剂盒选择禽流感病毒RNA作为靶区域。选择A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计多对通用引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。引物和探针从不同厂家合成，如上海生工、大连宝生物、中国国外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE纯或HPLC纯，到货时同时提供厂家对该产品的质检证明