细胞器蛋白的制备

细胞与细胞器蛋白质制备细胞与细胞器蛋白质提取蛋白质纯化细胞器蛋白的制备第1页细胞及细胞器蛋白质提取

意义：

在研究细胞时经常要研究细胞不一样组份，而研究得最多细胞组份就是细胞核、线粒体和细胞浆。分离细胞核、线粒体和细胞浆蛋白，不但能够用于研究蛋白在细胞内定位，而且很多时候分离出来蛋白能够用于细胞信号转导通路方面研究。

细胞器蛋白的制备第2页细胞及细胞器蛋白质提取1.细胞核蛋白质提取2.线粒体及细胞浆蛋白质提取3.全细胞蛋白质提取细胞及细胞器蛋白提取

细胞器蛋白的制备第3页1.细胞核蛋白质提取（1）取对数生长HeLa细胞计数，按1.6×106个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当初间；（2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000rpm/min离心5分钟，弃上清；（3）用1ml预冷PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷EP管，离心升至1rpm/min即停顿，弃上清；（4）细胞沉淀用homogenizationbuffer重悬；（5）使用Douncehomogenizer对细胞重悬液进行homogenize，操作次数视细胞株与操作人而定；（6）4℃、1000/min离心5分钟，弃上清，沉淀即为细胞核；（7）向细胞核沉淀中加入适量裂解液RIPA，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次；（8）4℃、1rpm/min离心15分钟，弃沉淀，将上清移入新预冷EP管；（9）取细胞核蛋白质进行BCA定量；（10）取等量细胞核蛋白质进行SDS电泳分析。细胞器蛋白的制备第4页2.线粒体及细胞浆蛋白质提取（1）取对数生长HeLa细胞计数，按1.6×106个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当初间；（2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000rpm/min离心5分钟，弃上清；（3）用1ml预冷PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷EP管，离心升至1rpm/min即停顿，弃上清；（4）向细胞沉淀中加入91μl/管MitochondriaIsolationKit试剂A（含蛋白酶抑制剂），中速旋涡震荡5秒钟，冰上孵育2分钟；（5）接着加入10μl/管MitochondriaIsolationKit试剂B（含蛋白酶抑制剂），高速旋涡震荡5秒钟，冰上孵育5分钟；（6）再加入100μl/管MitochondriaIsolationKit试剂C（含蛋白酶抑制剂），颠倒混匀，4℃、700g离心10分钟，弃沉淀；细胞器蛋白的制备第5页2.线粒体及细胞浆蛋白质提取（7）将上清移入新预冷EP管，4℃、12,000g/min离心15分钟，沉淀含线粒体，将上清移入另一新预冷EP管，再一次4℃、12,000g/min离心60分钟或4℃、100,000g/min离心15分钟，上清即含胞浆蛋白质；（8）向含线粒体沉淀中加入60l/管MitochondriaIsolationKit试剂C（含蛋白酶抑制剂），混匀清洗沉淀，4℃、12,000g离心10分钟，弃上清；（9）向沉淀中加入适量细胞裂解液RIPA，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次；（10）4℃、1rpm/min离心15分钟，弃沉淀，将上清（即含线粒体提取物蛋白质）移入新预冷EP管；（11）取胞浆蛋白质和线粒体蛋白质进行BCA定量；（12）取等量蛋白质胞浆和线粒体样品进行SDS电泳。细胞器蛋白的制备第6页3.全细胞蛋白质提取（1）取对数生长HeLa细胞计数，按1.6×106个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当初间；（2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000rpm/min离心5分钟，弃上清；（3）用1ml预冷PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷EP管，离心升至1rpm/min即停顿，弃上清；（4）向细胞沉淀中加入适量细胞裂解液RIPA或IP，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次；（5）4℃，1r/min离心15分钟，上清转移至新EP管中，采取BCA蛋白定量试剂测定蛋白质浓度留待其它试验。细胞器蛋白的制备第7页注意事项1.抽提蛋白全部步骤都需在冰上或4℃进行。2.全部试剂及器具均需预冷后使用，以确保蛋白质完整性及活性。细胞器蛋白的制备第8页蛋白质纯化意义：

伴随分子生物学发展，越来越多科研人员熟练掌握了分子生物学各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表示变得越来越轻易。但分子生物学上游工作往往并非最终目标，分子克隆与表示往往是要拿到纯表示产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗生物制品。细胞器蛋白的制备第9页蛋白质纯化普通标准主要将目标蛋白和其它细胞成份如DNA、RNA等分开，因为此时样本体积大、成份杂、要求所用树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并能够快速将蛋白与污染物分开，预防目标蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高分辨率，此阶段是要把目标蛋白与那些大小及理化性质靠近蛋白区分开来，要用更小树脂颗粒以提升分辨率，惯用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂选择性和柱效两个原因。蛋白纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化两个阶段。粗分离阶段精细纯化阶段细胞器蛋白的制备第10页选择性指树脂与目标蛋白结合特异性。柱效则是指各蛋白成份逐一从树脂上集中洗脱能力，洗脱峰越窄，柱效越好。细胞器蛋白的制备第11页各种蛋白纯化方法及其优缺点离子交换色谱亲和层析排阻层析疏水作用层析电泳细胞器蛋白的制备第12页离子交换色谱原理：

离子交换层析(IEC)是以离子交换剂为固定相，以含特定离子溶液为流动相，利用离子交换剂上可交换离子与溶液中离子发生交换作用，因为不一样溶质离子与离子交换剂上离子化基团亲和力和结合条件不一样，洗脱液流过时，样品中离子按结协力弱强先后洗脱,而将混合物中不一样离子进行分离技术。细胞器蛋白的制备第13页离子交换色谱原理：

蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不一样pH环境中所带总电荷不一样。大多数蛋白在生理pH（pH6-8）下带负电荷。需用阴离子交换柱纯化，极端pH下蛋白会变形失活，应尽可能防止。因为在某个特定pH下不一样蛋白所带电荷数不一样，与树脂结协力也不一样，伴随缓冲液中盐浓度增加或pH改变，蛋白按结协力强弱被依次洗脱。细胞器蛋白的制备第14页离子交换色谱细胞器蛋白的制备第15页离子交换色谱优点离子交换特异性好

树脂也比较廉价

缺点仅用离子交换单一方法得不到纯蛋白，还需要其它纯化步骤。细胞器蛋白的制备第16页亲和层析亲和层析是一个层析技术，经过生物分子之间特异性相互作用分离生物分子.原理：填料上配基与生物大分子特异结合，用特殊洗脱条件把被吸附生物分子洗脱下来。一个亲和色谱填料只能用于一个或有限一类生物分子。目标蛋白与固相化配基特异结合而滞留，其它杂蛋白会流过柱子。细胞器蛋白的制备第17页细胞器蛋白的制备第18页亲和层析优点：

亲和层析是最有效生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性吸附和分离，能够取得很高纯化倍数。另外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质愈加稳定，其结果提升了活性回收率。另外它能够降低纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白纯化十分有利。细胞器蛋白的制备第19页疏水作用层析原理：

疏水作用层析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）是依据分子表面疏水性差异来分离蛋白质和多肽等生物大分子一个较为惯用方法。蛋白质和多肽等生物大分子表面经常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁能够与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不一样分子因为疏水性不一样，它们与疏水性层析介质之间疏水性作用力强弱不一样，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子。细胞器蛋白的制备第20页疏水作用层析疏水作用层析基本原理如图所表示：细胞器蛋白的制备第21页排阻层析凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒如同一个筛子。当样品溶液经过凝胶柱时，相对分子质量较大物质沿着凝胶颗粒间孔隙，伴随溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小物质可自由地进出凝胶颗粒网孔，使流量增加，移动速率慢而最终流出层析柱。中等大小分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这么，经过层析柱，混合物中各物质按其分子大小不一样而被分离。带网孔葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出细胞器蛋白的制备第22页排阻层析优点纯化蛋白分子量范围宽，TosohBiosep企业聚合物树脂，排阻极限可达00kD

树脂微孔形状适合分离球形蛋白质，纯化过程中也不需要能引发蛋白变性有机溶剂。

缺点一些蛋白不适适用凝胶过滤纯化，电荷密度较高蛋白轻易吸附在上面树脂本身也比较昂贵细胞器蛋白的制备第23页电泳