多管发酵法测自来水大肠菌群

综合实验：多管发酵法测自来水大肠菌群组员：李妍、马万贵、石真真、李招柳、池小辉一、实验目的一、实验目的1、2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;1、2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系;3、4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。二、实验原理3、4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。二、实验原理培养学生自主设计并完成实验的能力，激发学生的科研主动性与积极性;大肠菌群一一能在37°C24-48h内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，易于培养和观察。粪便中存在大量的大肠菌群细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性。水中病原菌浓度很低，测定手续复杂，工作人员还有被感染传播的危险。所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测大肠菌群。多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵3个部分。初发酵中发酵乳糖产酸、产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性（液体培养基含有乳糖、蛋白胨和漠甲酚紫。由于许多细菌不能发酵乳糖，不生长，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）乳糖起选择性碳源的作用。

漠甲酚紫是PH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点PH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的PH由中性下降呈酸性，培养基从紫色变为黄色。另外，漠甲酚紫还具有抑制其他细菌（如芽抱杆菌）生长的作用）。平板分离一般利用大肠菌群在伊红美蓝（EMB培养基）上形成紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断（作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核的、有金属光泽的深紫色菌落。将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽抱杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落）。最后进行复发酵进一步证实。三、实验材料及用具三、实验材料及用具1、2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水1、2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水培养基：伊红美蓝培养基（EMB培养基）、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白培养液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液3、仪器及用具：三角瓶（2个）、发酵用试管（32个）、发酵用烧3、瓶（4个）、杜氏小管（36个）、培养皿（12个）、移液管、接种环、酒精灯、记号笔、油镜四、操作步骤四、操作步骤（一）水样的采取1、自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。2、池水：采用邮电学院喷泉水池中的水。取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。（二）多管发酵法检测大肠菌群1、自来水的检测（1）初发酵试验接种水样总量为300ml:在2个含有50ml3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液发酵烧瓶（内倒置杜氏小管）中，各加入100ml水样。在10支含有5ml3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液发酵管（内倒置杜氏小管）中，各加入10ml水样。混匀后，37°C培养24h,24h未产气的继续培养至48h。（2）平板分离：取出培养后的发酵管，观察管中颜色变为黄色者记录为产酸，杜氏小管中有气泡者记录为产气。将产酸产气和只产酸的两类发酵管（瓶）分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，37C下培养24h。挑选：深紫黑色、有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽;淡紫红色、中心颜色较深的菌落（其初发酵管记录为阳性）的一部分进行革兰氏染色，镜检。（3）复发酵实验：经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取菌落的另一部分，重新接种于乳糖蛋白胨培养液的复发酵管（内倒置杜氏小管）中，每管可接种同一发酵管的典型菌落1~3个，37C培养24h。若为产酸产气者表明试管内有大肠菌群存在，记录为阳性管，再根据初发酵实验的阳性管（瓶）数查表9-10，即得总大肠菌群。

表*10大肠菌群检敷表接种水样总量300nH(100ml2份，1。血110份)100m】水最的阳性瓶10ml永量的阳性管数012】L水样中大肠菌群数1L水样中大版箭群数1L水样中大曲曲群数0<31u13918,27，13273J1[838414U&25J&30706223392727431208315116193660230104089>2302、池水的检测将水样稀释成10-1与10-2.分别吸取lml10-1与10-2的稀释水样和lml原水样，各注入装有10ml乳糖蛋白胨培养液发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注人装有5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管(瓶)中。初发酵实验、平板分离和复发酵实验发酵结果查阅接种水样总量为111.11ml检索表。事XV-5大瞒菌群检敏素接神水样EMtlU.lml(100ml.IDml、Iml,f)1mlXi接韩水样K/ml每升水样中大肠蔺群数10010]0.1*+99+9.5++Ifi十+19♦一 +b ± 2223+++28-+■+£>2+十94++180++(230+++960+ 1++2380十+++>2380"大肠菌群Jfc酷阳性L-"大IK前醉发酢明性,五、结果记录2、池水多管发酵法