高效液相色谱法测定大鼠血浆中总槲皮素浓度及其药动学研究

高效液相色谱法测定大鼠血浆中总槲皮素浓度及其药动学研究

黄酮类化合物，化学名称为3、3'、4'、5-7-黄酮，具有多种生物学活性和高疗效。槲皮素存在于多种植物的花、叶和果实中,具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护等作用有93.3%的槲皮素经口服后,在被肠道吸收的同时即被代谢,代谢部位主要是小肠,生成甲基化、葡糖醛酸化、硫酸化等7种Ⅱ相代谢产物。研究表明,槲皮素被人体吸收代谢后,最终以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3’-O-硫酸盐等结合形式而存在1材料表面1.1色谱线的测定岛津LC-20ATProminence高效液相色谱仪(配备LC-20AT输液泵,SPD-M20APDA检测器,SIL-20A自动进样器,LGC-1025M柱温箱,CBM-20Alite系统控制器及LC-solution色谱工作站);AUW-220D电子分析天平(日本岛津公司);SORVALLLegendMICRO21R型高速低温冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。1.2阿魏酸对照品槲皮素对照品(批号10081-201408,纯度99.1%),中国食品药品检定研究院;阿魏酸对照品(批号110773-201313,纯度99.6%),中国食品药品检定所;β-葡萄糖醛酸酶(批号SLBG9373V,来自罗曼蜗牛,H-3型,纯度≥90000U·mL1.3实验动物中心SD大鼠,SPF级,雄性,体质量200~220g,购自华中科技大学实验动物中心,许可证号为SCXK(鄂)2010-0009。2方法和结果2.1溶液制备2.1.1内标溶液精密称取阿魏酸对照品10.73mg,置于50mL量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,得213.74μg·mL2.1.2对照溶液精密称取槲皮素对照品10.16mg,置于100mL量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,得100.69μg·mL2.1.3超纯水溶液制备称定乙酸铵3.854g,维生素C0.20g,用超纯水溶液转移至100mL量瓶中定容,乙酸调至pH5.0,得0.5mol·L2.2%磷酸溶液色谱柱:InertsilODS-SP柱(150mm×4.6mm,5μm),GLSciences;流动相:乙腈-0.2%磷酸水溶液(30∶70);流速:1.0mL·min2.3酶工作液制备精密吸取血浆样品100μL至1.5mLEP管中,加入酶工作液20μL,涡旋30s,于37℃水浴1h,加入2.5mol·L2.4理论与实践的确认2.4.1空白血浆色谱图分别取来自6只未给予任何药物的雄性SD大鼠的空白血浆100μL,用等体积乙腈替代内标工作液,按“2.3”项下操作,得空白血浆色谱图(图1A);并取以上6只大鼠的空白血浆90μL,加入1.05μg·mL2.4.2标准曲线和定量限lloq2.4.3质控标准溶液精密吸取空白血浆90μL,加入10μL“2.1.2”项下的各质控标准溶液,配制成相当于槲皮素浓度为0.157,1.259,8.056μg·mL2.4.4峰面积a的确定按“2.3”项下处理低、中、高3个浓度的QC血浆样品,每个浓度5个样品进行分析,获得相应峰面积(A);另取空白血浆按“2.3”项下处理,再加入低、中、高3个浓度的QC溶液及内标溶液,进样分析,获得相应峰面积(B),以(A/B)计算血浆中槲皮素的提取回收率,结果见表2。2.4.5样品的稳定性研究按“2.4.2”项下方法配制含槲皮素浓度为0.157,1.259,8.056μg·mL2.4.6溶液稳定性配制质量浓度为10mg·L2.5组药前配合物及单次灌服槲皮素以下简称槲皮素8只SD雄性大鼠,体质量(200±20)g,实验前适应性喂养1周,给药前禁食不禁水12h,于称重后单次灌服槲皮素(50mg·kg3血浆样本的提取槲皮素经口服摄入后,在通过小肠的过程中或被结肠内活性细菌迅速水解为槲皮素糖苷配基。接着这些糖苷配基在Ⅱ相代谢酶如UDP葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和硫酸基转移(sulfotransferases,SULTs)的作用下,被代谢为葡萄糖醛酸化和硫酸化衍生物本研究在血浆样本的处理中,考察了蛋白沉淀和液液萃取两种方法。蛋白沉淀法虽然操作简便,但进行处理时需要的全血样品量较大,而同一只大鼠一天内要采十几个点,为满足蛋白沉淀法处理全血样品所需的样本量,大鼠很容易处于失血状态,从而影响药动学结果;并且在操作过程中发现,蛋白沉淀法的提取效率不高,故本研究选择采用液液萃取法来处理血浆样本,并分别考察了乙醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚作为提取溶剂,因乙酸乙酯提取效率高、干扰少、安全经济,最终选择乙酸乙酯。在内标的选择上,先考察了测定槲皮素的常用内标物质山萘酚,结果发现内标物质不稳定,无法对槲皮素准确定量。最后选定阿魏酸作为内标物质,发现两者峰形、分离度均较好,并且重复性好,因此选择阿魏酸作为测定槲皮素的内标。本研究对大鼠灌胃给药后的药动学结果显示槲皮素在SD大鼠体内的半衰期在6h左右,达峰时间在8h左右。在一篇用高效液相色谱法测定血浆中游离槲皮素的药动学报告中,在给予同本研究相