非洲猪瘟的流行病学、流行与防治

非洲猪瘟的流行病学、流行与防治

非洲猪疫情（asf）是由非洲猪疫情病毒（asfv）引起的急性、烈性和高度接触性传染病。ASF在1921年于非洲的肯尼亚发生，其后扩散到非洲各国及欧洲、南美洲。2007年以来，ASF在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。该病早期发现难、防控难、根除难，被称作养猪业的头号杀手，我国将其列为一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告动物疫病。自从2018年ASF传入我国后，给养猪业造成巨大的损失。ASFV属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属成员，只有1个血清型，可分为24个基因型1材料和方法1.1病毒的血样、发酵非洲猪瘟病毒Ⅱ型(ASFVⅡ型)基因组DNA,浓度0.73×10非洲猪瘟病毒株来自广东省动物卫生监督所，是广州华医测检测科技有限公司2019年5月份参加广东省非洲猪瘟能力验证所留存样品，编号分别为A32、A193、A51、A99、A174,为含灭活病毒的血样。猪瘟活疫苗，购自广东永顺生物制药有限公司；猪传染性胃肠炎灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，购自武汉科前生物股份有限公司；猪肺炎支原体活疫苗，购自齐鲁动物保健品有限公司；口蹄疫灭活疫苗，购自天康生物有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，购自中牧实业股份有限公司。MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0,购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒，购自天根生物科技有限公司；PEASY-T1SimpleCloningKit,购自北京全式金生物技术有限公司；荧光定量PCR仪(StepOnePlus),赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；凝胶成像系统(Tanon1600)、电泳仪(EPS300),上海天能科技有限公司产品。1.2方法1.2.1猪肺炎产物的核酸提取采用MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0,按照说明书进行操作，分别提取非洲猪瘟病毒(灭活)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪肺炎支原体的核酸，主要的提取过程是：取200μL样品，加入200μL的bufferVGB、20μL的ProteinaseK和1.0μL的CarrierRNA,充分混匀，于56℃水浴温浴10min。向裂解液中加入200μL无水乙醇，充分吸打混匀。将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12000r/min离心2min,弃滤液。将500μL的bufferRWA加入SpinColumn中，12000r/min离心1min,弃滤液。将700μL的bufferRWB加入SpinColumn中，12000r/min离心1min,弃滤液。重复上一步骤。将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000r/min离心2min。将SpinColumn安置于新的1.5mLRNasefreecollectiontube上，在SpinColumn膜的中央处加入30μL～50μL的RNasefreedH1.2.2n/hlj/2018根据非洲猪瘟病毒流行毒株Pig/CN/HLJ/2018(GenBank:MK333180.1)分别设计B646L(P72)和EP402R(1.2.3反应体系及程序以p72-F、p72-R上、下游引物扩增，按照以CD2v-F、CD2v-R上、下游引物扩增ASFVCD2v基因，反应体系如上。反应程序：预变性94℃4min;变性94℃30s,退火50℃30s,延伸72℃30s,35个循环；72℃延伸10min。将扩增目的片段与PEASY-T1载体连接，转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，挑选阳性重组克隆，由上海生工生物工程有限公司测序鉴定。将正确插入阳性质粒拷贝数的计算公式为：(6.02×101.2.42-定量实时荧光pcr检测方法的建立1.2.4.单次广泛化煌pcr反应条件的优化用浓度为5.02×101.2.4.2cd2v单次荧光定量pcr反应条件的优化用浓度为7.7×101.2.4.p372-cd2v双重荧光定量pcr反应条件的优化以浓度为5.02×101.2.4.标准曲线的配置分别对T1-p72和T1-CD2v阳性质粒进行10倍系列稀释，使其浓度范围分别为5.02×101.2.4.5.最低检测限制对非洲猪瘟病毒(ASFVⅡ型)基因组DNA标准物质进行10倍倍比稀释，使其浓度为0.73×101.2.4.6年和特异性分别选取3个浓度的T1-p72阳性质粒(5.02×101.2.4.阴性样品测定检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本，2019年5月留存的非洲猪瘟病毒(灭活)参考样品5份，其中A32和A193为阴性，A51、A99、A174为阳性。上述样品经常规处理后，采用MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒，按操作说明书提取样品RNA/DNA,用建立的双重荧光定量PCR方法进行检测。2结果2.1pcr扩增asfv核酸分别以p72-F、p72-R上、下游引物，CD2v-F、CD2v-R上、下游引物扩增ASFV核酸，经琼脂糖凝胶电泳后，p72在160bp处有明显条带、CD2v在144bp处有明显条带(图1)。测序后，T1-p72、T1-CD2v的插入片段用DANSTAR软件与Pig/CN/HLJ/2018进行序列比对，同源性为100%。2.2p72基因荧光定量pcr反应条件的优化用浓度为5.02×102.3c-2v基因荧光定量pcr反应条件的优化用浓度为7.7×102.4p72和cd2v基因的双荧光定量pcr反应条件的优化以浓度为5.02×102.5标准曲线的构建对T1-p72阳性质粒、T1-CD2v阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度范围分别5.02×10copies/μL～5.02×102.6最小检测线限非洲猪瘟病毒(ASFVⅡ型)基因组DNA标准物质10倍倍比稀释后的浓度为0.73×102.7重复试验分别选取3个浓度的T1-p72阳性质粒(5.02×102.8疫苗核酸检测以猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗、猪圆环病毒2型疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪支原体疫苗和猪流行性腹泻疫苗的核酸为模板，按优化后双重荧光定量PCR反应条件进行检测。结果显示，仅阳性对照T1-p72和T1-CD2v有特异性扩增曲线，CSFV、FMDV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、猪肺炎支原体均无特异性扩增。2.9非洲猪景观检测结果检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本，结果显示，105份样品均无非洲猪瘟病毒扩增。检测2019年5月留存的非洲猪瘟灭活样品5份，其中A32和A193为阴性，A51、A99、A174为阳性。国内非洲猪瘟疫情首次暴发于2018年8月，因此105份的检测结果与实际相符。5份留存的非洲猪瘟灭活样品的检测结果与广东省动物卫生监督所的结果一致。3实时荧光定量pcr在非洲猪蚤体内的应用实时荧光定量PCR技术(real-timePCR)从1995发展至今，其高通量、快速、准确、灵敏的特点使其广泛应用于临床医学检验、动植物检疫以及食品安全等。实时荧光定量PCR被认为是ASFV检测的金标准。目前对非洲猪瘟野毒的鉴定主要是针对本文建立的双重荧光定量PCR可在1个反应管内同时检测ASFVp72和CD2v基因。同时检测ASFVp7