药物的抗病毒实验

二、内容（一）原理病毒是一类结构简单、非细胞形态专性细胞内寄生微生物，必须在易感活动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。所以可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药品抗病毒试验。可经过观察细胞培养液酸碱度改变、病毒致细胞病变效应（CPE）、病毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水平改变、鸡胚尿囊液或动物血清等对应指标改变，来判断药品抗病毒试验效果。药物的抗病毒实验第1页（二）材料1.9~10d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀鸡卵（莱亨鸡受精卵因为卵壳薄，在孵育过程中便于检验，为首选）2.Hep-2细胞或MDCK细胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.药品：试验药品，阳性对照药5.动物：小鼠等（三）操作方法药物的抗病毒实验第2页 鸡胚培养为惯用病毒培养法之一，当前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒分离、判定、制备抗原和疫苗生产等。1.接种方法 病毒鸡胚培养法主要有四种接种路径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不一样病毒应选择各自适宜接种路径，并依据接种路径确定鸡胚孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。一）鸡胚法药物的抗病毒实验第3页

表6-1

鸡胚孵育日龄及接种路径选择接种病毒名称接种部位鸡胚日龄收获材料痘类病毒、单纯疱疹病毒绒毛尿囊膜9-10绒毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒首次分离羊膜腔12-14羊水一些嗜神经性病毒卵黄囊5-6卵黄液药物的抗病毒实验第4页2.IFV-FM150%鸡胚感染量（EID50）测定用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别接种鸡胚，0.1ml/胚，同时设正常对照，共6组，每组5胚。35℃孵育72h，置4℃冰箱过夜，搜集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算FM1EID50。药物的抗病毒实验第5页3.药品对鸡胚毒性作用选用健康9~11日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和对照药作10倍系列稀释5~6个浓度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml，每个浓度接种5胚，0.25ml/胚。35℃培养5d后观察结果（死亡/存活）。确定两种药品对鸡胚最大无毒剂量（TC0），用于正式试验。药物的抗病毒实验第6页4.药品对FM1抑制作用鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不一样浓度药液注入鸡胚中，0.25ml/胚，30min后经相同路径注入100EID50病毒0.1ml，对照组以生理盐水代替。35℃温箱孵育5d。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上所注射最小药品量，即为其最小抑制剂量（MIC）。药物的抗病毒实验第7页4.1鸡胚接种（1）孵育9~10d左右鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。（2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸收病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎长轴刺入0.5~1.0cm深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。（5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于35~36℃温箱内培养二天，天天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置-20℃冰箱2h后，无菌操作收获尿囊液。药物的抗病毒实验第8页4.2尿囊液收获（1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。（2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分卵壳。（3）用无菌毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸收尿囊液（防止血管破裂），置于无菌试管中。（4）取得尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒增殖情况并对病毒进行判定；同时做无菌试验。药物的抗病毒实验第9页4.3血凝和血凝抑制试验（1）血凝试验 血凝试验详细操作方法，参考本教材第四章第四节内容：病毒分离培养判定和血清学检测。[结果判断]以“+”号多少表示血凝程度：++++100％RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状；+++75％RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势；++50％RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四面有小凝集块；+25％RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块；-100％RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。 以使50％RBC发生凝集最高稀释倍数，为病毒血凝效价。计算药品MIC。药物的抗病毒实验第10页（2）病毒血凝抑制试验 依据血凝试验滴定病毒血凝效价，以“2＋”凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液配制成含4个血凝单位时，应稀释成1:（160÷4），即1:40稀释。在做血凝抑制试验时用4个血凝单位。将病毒液配成4个血凝单位。血凝抑制试验方法，参考本教材第四章第四节内容：病毒分离培养判定和血清学检测。药物的抗病毒实验第11页主要依据细胞对病毒敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴组织较敏感，所以，研究人病毒性疾病惯用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培养方法中以单层细胞培养是最惯用方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本试验仅介绍对传代细胞操作方法。二）细胞培养法药物的抗病毒实验第12页1.病毒TCID50滴定（1）原理多数病毒感染体外培养细胞后，常引发细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathiceffect，CPE），能够直接经过显微镜观察，亦可经过染色得以识别和判断。CPE程度可间接反应病毒毒力，所以利用这种特征能够用来测定病毒毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引发细胞发生病变所需病毒量，定义为病毒50％组织细胞感染指数（50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在从事药品抗病毒试验中，惯用100TCID50病毒感染量进行。药物的抗病毒实验第13页测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生CPE不再进展为止。详细时间依据病毒增殖特点而定，如肠道病毒增殖快速，普通48h即可；RSV、VSV增殖也较快，所以48~72h也能够观察、染色、计算。药物的抗病毒实验第14页（2）试验材料 细胞：MDCK细胞或Hep-2细胞，或其它敏感细胞。 病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。 试剂：DMEM细胞培养基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，结晶紫染液等。 材料：细胞培养板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/组），酒精缸，镊子（2个/组），1ml注射器，毛细吸管等。药物的抗病毒实验第15页（3）操作步骤1）制备细胞①将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培养液，用PBS小心洗涤2次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。②用上述吸管吸收1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约3～5min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停顿消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。药物的抗病毒实验第16页③加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。④计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为106/ml时即可。 一瓶细胞消化后加入适量营养液制成所需细胞悬液，浓度约为1×106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃、5%CO2孵育箱培养24h，形成单层后，做病毒滴定用。药物的抗病毒实验第17页2）50%组织细胞感染量（TCID50）测定①稀释病毒液：取无菌青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清维持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，重复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，重复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，重复混合三次，依这类推将待测病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-3…10-9。药物的抗病毒实验第18页②病毒接种：将长好单层细胞培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度IFV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100μl。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37℃、5%CO2孵育箱中孵育。③结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病毒可引发细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“-”表示细胞正常；“+”表示有25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”有50%细胞产生病变；“3+”有75%细胞产生病变；“4+”有75%以上细胞产生病变（试验时，有观察24h~48h即可染色计算；或逐日观察CPE，直至病毒产生CPE不再进展为止）。药物的抗病毒实验第19页3）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累积数（孔）病变细胞孔病毒稀释度病变孔数/接种孔数有病变↑无病变↓百分比百分比%药物的抗病毒实验第20页

按表中可见，10-3稀释病变高于50%；10-4稀释病变低于50%；50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式以下：

高于50%病变率-（50%）距离百分比=-高于50%病变率-低于50%病变率×lg稀释倍数

100-50

=-100-25×lg10=-0.67 lgTCID50=高于50%病变低稀释度对数+距离比=-3+(-0.67)=-3.67即1个TCID50=10-3.67，查0.67反对数为4.68，即病毒做4.68×103倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50%细胞产生病变。药物的抗病毒实验第21页 附录：怎样计算200个TCID50？ 4.68×103÷200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。按计算结果，用100个TCID50病毒进行药品体外抗病毒试验。药物的抗病毒实验第22页2.病毒增殖及病毒感染单位量测定2.1病毒增殖 将冻存病毒株复苏后接种于敏感细胞进行增殖，2~3d后出现经典细胞病变，待病变达80~90％时收获病毒。重复冻融3次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位试验（plaqueformingunit,PFU）测定病毒感染量，保留于-80℃备用。在进行药品抗病毒试验中，亦可用该试验测定药品对病毒增殖影响，而且结果可能更准确、可靠。药物的抗病毒实验第23页2.2病毒感染单位量测定 用PFU表示。以5.0×105/ml密度接种敏感细胞于6孔细胞板中。置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，使其24h内长成单层；在冰盘上操作，用维持液将病毒作10倍连续系列稀释（10-1～10-8）（操作以下列图所表示）；药物的抗病毒实验第24页注：即在一系列2mlEp管中先加入1.8ml维持液，取

0.2ml

病毒加入第一只Ep管中，充分混匀后病毒稀释度为10-1，取混合后0.2ml

病毒悬液加入第二只Ep管中作为稀释度10-2，依这类推作系列稀释，则得到连续10倍稀释病毒悬液。药物的抗病毒实验第25页弃去细胞培养板中各孔中营养液，每孔接种对应稀释度病毒悬液0.5ml，每个稀释度重复3孔。37℃吸附2h，每15min摇动数下以确保病毒吸附分布均匀；弃去各孔中病毒液，PBS轻轻洗涤一次。每孔加入2ml覆盖层（含6％新生牛血清DMEM与1.5％琼脂糖等体积混匀，配好后马上使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；药物的抗病毒实验第26页

33℃，5％CO2细胞培养箱中培养3d。剔除覆盖层，每孔加入1ml0.5％结晶紫染色10min，自来水冲洗后选择空斑数清楚且易于分辨稀释度计数空斑，依据空斑数计算病毒PFU。下列图显示是RSV空斑形成试验结果。PFU计算方法：a·b

PFU＝v（PFU：空斑形成形成单位/ml；a：空斑均数；b：病毒稀释度倒数；v：病毒量/ml）药物的抗病毒实验第27页

1：正常对照；2～6：病毒稀释度分别为

10－4，10－5，10－6，10－7，10－8

病毒空斑形成试验结果示意图

3

2

1654药物的抗病毒实验第28页2.药品对细胞毒性测定 已长成单层细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗涤2次，加入用无血清1640作连续10倍系列稀释受试药品，100µl/孔，每个浓度重复4孔，并设正常细胞对照。整个试验重复3次。37℃、5%CO2孵箱中培养3d，观察细胞病变效应（CPE），按Reed-Muench法计算药品半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。阳性对照药毒性测定，与受试药品同法同时在同一板中进行。药物的抗病毒实验第29页4.药品抗病毒试验4.1微量细胞病变抑制法 已长成单层细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗2次，加入100TCID50病毒，100µl/孔，37℃5%CO2下吸附2h，使病毒进入细胞内。弃病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游离病毒。加入受试药TD0浓度作连续2倍系列稀释6个浓度，每个浓度均重复3孔，并分别设置细胞对照、病毒对照和空白对照孔，阳性对照药同上。37℃、5%CO2下培养3d，统计CPE，按Reed-Muench法计算能抑制50%CPE产生药品有效浓度（EC50）。整个试验重复3次。药物的抗病毒实验第30页4.2中性红染色法

基本步骤同上，加入药品培养3d后待CPE不再进展时，弃维持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性红染液（0.04%），避光，37℃、5%CO2孵育1.5h。弃染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml90%乙醇（无水乙醇：0.2M，pH4.2枸橼酸缓冲液=9：1），室温放置2~3h，摇匀，以空白对照孔调零，在酶标仪546nm处比色，测定其吸光度A值。依据各组平均A值，计算药品抑制百分率，再按Reed-Muench法计算50%抑制浓度（IC50）等各项结果。整个试验重复3次。

试验组平均A值-病毒对照组平均A值抑制百分率=细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值×100%药物的抗病毒实验第31页4.3MTT法 基本步骤同上，当病毒对照组细胞CPE在(+++)～(++++)时弃培养液上清，每孔加入含5g·LMTT培养液50μl，继续培养2~3h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混匀5min后，用酶标仪测570nm波优点吸光度A值。按下述公式计算药品对病毒抑制率：病毒抑制率(%)=(药品处理组A均值-病毒对照组A均值)/(细胞对照组A均值-病毒对照组A均值)×100%，结合细胞毒性试验结果，用统计软件SPSS13.0Probit回归法，或按Reed-Muench法，计算受试药半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50，并计算药品治疗指数（TI）。药物的抗病毒实验第32页4.4空斑抑制法 参考上述方法进行（略），与病毒对照组比较，计算药品50%抑制浓度IC50。4.4药品对RSV侵入细胞阻断作用 依据药品毒性试验结果，从药品最大无毒浓度开始，将不一样浓度受试药100μl预先处理细胞2h,以PBS洗涤2次后用100TCID50病毒每孔100μl攻击,吸附2h，每隔15min摇摆1次，使病毒均匀吸附。弃病毒液,加100μl细胞维持液，置37℃、5%CO2培养，每日观察并统计CPE。试验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药品组。当病毒对照组CPE在75%~100%时弃培养液上清，每孔加入含5g·LMTT培养液50μl，继续培养2～3h后弃去MTT上清，每孔加100μlDMSO，混匀5min后，用酶标仪测490nm波优点A值。按Reed-Muench法计算药品半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。药物的抗病毒实验第33页4.5药品对RSV直接杀伤作用 依据药品毒性试验结果，从药品最大无毒浓度开始，将不一样浓度含药维持液与100μl100TCID50病毒等体积混合，37℃、5%CO2条件下作用2h后，再将其感染Hep-2细胞，100μl/孔，吸附2h后用PBS洗涤2次，每日观察并统计细胞病变效应（CPE）。试验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药品组。当病毒对照组细胞CPE在75%~100%时弃培养液上清，每孔加入含5g·LMTT培养液50μl，继续培养2~3h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混匀5min后，用酶标仪测490nm波优点A值。按Reed-Muench法计算药品半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。5.治疗指数（TI） 按TI=TD50/EC50或TD50/IC50进行计算。药理学试验要求，TI﹥4表示药品有效。药物的抗病毒实验第34页三）体内抗病毒试验1.试验动物选择

试验动物在病毒学研究中用途主要有：分离与判定病毒、制备疫苗及诊疗抗原、制备免疫血清、研究病毒致病性、免疫性、发病机理及有效药品疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种路径，主要取决于病毒种类和试验研究目标。应依据试验需要选择最敏感动物作为试验对象，惯用动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要依据病毒对动物及组织细胞亲嗜性而选择特定部位，惯用接种路径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。药物的抗病毒实验第35页采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行对应指标检测。为降低个体差异，普通试验选择成年动物，动物体重尽可能一致；如无特殊要求，试验动物性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜采取。另外，依据试验研究不一样准确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传控制方法和微生物控制标准培育而成动物。按遗传学控制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学控制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按一定级别动物喂养标准喂