羊肚菌菌核发育形态、IMV检测及原生质体融合技术研究

羊肚菌菌核发育形态、 检测及原生质体融合技术研究羊肚菌在生物分类上属于子囊菌门,为世界著名的食药兼用用菌,风味独特,并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗肿瘤等多种生物活性。201年2以来,羊肚菌大田栽培首次在我国四川成功实施并快速向全国辐射。然而,与羊肚菌人工栽培快速发展形势不相称的是,羊肚菌的基础理论研究还比较落后,限制了羊肚菌产业的持续健康和稳定发展。譬如,羊肚菌菌核发育机制、菌种质量评价、育种新技术应用等研究,将促进羊肚菌生产的健康发展。本研究采用电子显微术和激光共聚焦显微术研究了羊肚菌菌核发育过程中的形态和生理变化,发现羊肚菌菌核发育涉及了自噬、凋亡和坏死等事件,羊肚菌菌核的能量储存物质为脂肪建立了羊肚菌栽培菌株身份（ ）、交配型（ g和活力（ ）的 检测技术可用于羊肚菌人工栽培菌株在大生产中的适应性检验;优化了羊肚菌原生质体释放和再生技术,建立了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活融合技术,获得了一批融合菌株,对推动羊肚菌原生质体融合育种技术发展具有现实意义。主要研究结果如下:（1）对梯棱羊肚菌1号菌株,菌丝重复分枝和末端菌丝或亚末端菌丝分枝的扩大形成菌核原基其菌核发育兼具末端型和侧生型特性,为复合型;透射电子显微术研究发现羊肚菌菌核发育涉及了自噬、凋亡和坏死事件;活细胞共聚焦激光成像研究揭示了菌核中的能量储存物质为脂质性质。脂肪的定性测定表明,菌核中积累的脂肪多于营养菌丝细胞。（2）分别采用/ / 引物对实验室保存的种羊肚菌的基因组进行扩增测定了其、 、 基因序列并进行了序列比对分析。株20、113号、号-为3六妹羊肚菌（）菌株同源相似性为株20、113号、号-为3六妹羊肚菌（）菌株同源相似性为可信度为。0设%计和筛选了羊肚菌交配型基因测定的特异性引物度发现引物对可特异性鉴定六妹羊肚菌的交配型度引物对能够鉴定梯棱羊肚菌的交配型。采用筛选的引物对分别对测定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因组进行扩增发现每对引物均能扩增出条清晰的条带并且混合引物均能扩增出两个条带。这些结果表明,筛选的引物对可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的交配型分析,测试的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未发生交配型缺失,六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均属于典型的异宗结合真菌。测定了六个羊肚菌菌株的脂质过氧化水平度评价菌株的衰老情况。结果发现度菌株和 老化程度最高菌株0号活力最强菌株号、老化程度介于二者之间。（3）对梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生质体释放条件进行了优化。结果表明度梯棱羊肚菌原生质体制备的最优条件为稳渗剂为 甘露醇酶液体系为溶壁酶蜗牛酶纤维素酶菌龄为。在该优化条件下梯棱羊肚菌原生质体产量为X 个原生质体再生率可达1.8。%六妹羊肚菌原生质体制备最佳条件为:稳渗剂为0.6甘露醇酶液体系为溶壁酶蜗牛酶纤维素酶菌龄为 。在该优化条件下六妹羊肚菌原生质体产量为 X 个原生质体再生率可达1.。5（溶4）优化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活原生质体融合条件。结果表明,2种羊肚菌种间原生质体融合的最优条件为:原生质体融合温度5溶液 终浓度 融合剂浓度。在优化条件下,原生质体融合率可达0.。8%（）筛选了鉴定种羊肚菌的特异性 （随机扩增多态性 ）分子标记。测定了亲本及融合子的 标记通过聚类分析发现双亲本与融合子可分为3大类群:第一类群包括亲本梯棱羊肚菌（1第二类群包括所有融合子第三类群包括亲本六妹羊肚菌（）。16个融合子可以分为3组,其中1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16为一组,4、7为一组,2、3为一组。这些结果表明,采用梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活融合技术获得的羊肚菌原生质体融合子为真正的融合子。（）分别选取融合子号（）、融合子号（）、融合子号（4和双亲本进行培养,比较每种融合子和双亲本菌株的菌落形态差异,发现梯棱羊肚菌（）、六妹羊肚菌（）、、、均产菌核且产量多菌核形态均为点状按照菌丝生长速度各菌株的排列顺序为 但菌株生长速度相差不大不同菌株的菌块恢复时间不同其中恢复时间最长恢复时间最短号、号和号融合子介于二者之间、、、的菌丝紧密、稀疏所有菌株菌落边缘均整齐。这些结果表明种羊肚菌的融合子为真正的融合菌株。（）人工栽培发现融合子和子囊果形态上接近号亲本（为六妹羊肚菌） 和形态接近于号亲本（为梯棱羊肚菌）而和介于两亲本之间。（8、人工栽培表明,、亲本与6个融合子8个菌株产量之间均差异显著没有任何融合子菌株产量超过亲本菌株而融合子产量