细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架

细胞生物学试验-免疫荧光观看细胞骨架细胞骨架的免疫荧光标记及定位观看免疫荧光技术〔Immunofluorescencetechnique〕又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中进展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的根底上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反响进展组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次承受荧光素进展标记并获得成功。依据抗原抗体反响的原理，先将的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。荧光素在肯定条件下可与抗体分子结合同时不影响抗体免疫活性的特性。用荧光抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原与标记抗体特异性结合，形成的免疫复合物固定于细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下可以观看到发出荧光的可见物体，从而可以对抗原或抗体的性质进展定性、定量和定位分析。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素〔FITC〕和罗丹明〔Rhodamine〕等。免疫荧光的应用范围极其广泛，可以用于内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞外表抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质的争论。免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：存在非特异性染色，结果判定的客观性缺乏，步骤比较简单。免疫荧光分为直接法、间接法和补体结合法。直接法：将荧光素直接偶联在一抗上，不需要二抗。检查抗原法：这是最早的方法，用特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反响，而将抗体定位检测出来。间接法:先用未标记的特异抗体〔一抗〕与抗原结合，再用有荧光素标记的抗抗体〔二抗，如抗IgG的抗体〕与标本反响，样品中假设有与一抗结合的抗原存在，则会形成抗原-抗体-抗抗体复合物从而到达染色的目的。检查抗体法：此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反响，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，由于抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。检查抗体法：在样品中加上待检血清，假设血清含有样品中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体〔如抗种属特异性的IgG荧光抗体〕与结合在抗原上的抗体反响，在荧光显微镜下可见抗原抗体反响部位呈现光明的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。检查抗原法：先用特异性抗体〔一抗〕与样品反响，再用 PBS洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体〔二抗〕与结合在抗原上的抗体〔二抗的抗原〕结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了灵敏度。这是现在最广泛应用的技术。补体结合法：又称抗补体染色法，是间接染色法的一种改进，基于补体结合反响的原理，通过荧光标记抗补体的抗体，用于鉴定未知抗原或未知抗体〔待检测的血清〕。直接检查组织内免疫复合物法：用抗补体的荧光抗体直接作用于组织切片，荧光抗体可以和结合在抗原抗体复合物上的补体反响，形成抗原抗体补体复合物－抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。间接检查组织内抗原法：常将颖补体与一抗混合后同时加在组织切片上37℃孵育，如发生抗原补体抗体反响，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反响，形成抗原－抗体－抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的一抗的标记显示。荧光素靶蛋白二抗一抗高特异性的抗体是免疫荧光试验的关键，但是很多的实际争论没有商品化的抗体，就需要制备免疫血清和纯化免疫球蛋白，需要留意1.在抗体制备过程中，用于免疫的抗原必需是高度提纯的，尽可能不含其它非特异的抗原物质；2.从免疫血清中将特异性抗体提纯必需保证抗体的高度纯化，尽量削减非特异抗体的存在。〔除去未结合荧光素：透析法，凝胶过滤法；除去标记不适当的抗体：离子交换层析法，其中未结合荧光素的抗体所帶负电少，最先洗出。过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最终洗出；除去非特异反响物质：将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉末预先吸取。〕除了自己制备抗体之外，还可以承受间接法免疫荧光技术，一抗一般是靶蛋白或者靶蛋白所耦联Tag的抗体，二抗则是通用的抗IgG的抗体〔抗鼠、抗兔、抗羊等〕。如以下图所示：免疫荧光中的抗原和抗体常用的荧光素异硫氰酸荧光素〔Fluoresceinisothiocyanate，FITC〕：黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸取光波长为490－495nm，最大放射光波长520－530nm，呈现光明的黄绿色荧光，构造式如下：有两种同分异构造，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合力量等方面都更好，在冷暗枯燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。四乙基罗丹明〔Rhodamine〕：橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。构造式如下：最大吸取光波长为570nm595－600nm，呈橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明〔Tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC〕：最大吸引光波长为550nm，最大放射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光比照鲜亮，可协作用于双重标记或比照染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。1、固定固定的目的：使细胞内蛋白质凝固；去除阻碍抗原抗体结合的类脂质；终止或削减内源性或外源性酶反响；防止细胞自溶并保持细胞固有形态和构造；最重要的是保持细胞内的抗原性，从而使抗体能有效特异识别胞内抗原。固定的标准：不能损伤细胞内的抗原；不能凝集蛋白质；应保持细胞和亚细胞构造；固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入全部细胞或亚细胞组分并与抗原结合。常用的固定剂：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞构造蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络构造。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的构造，但由于交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要通透处理使抗体进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白为抗原制备的抗体在免疫荧光中效果更好，样品中有荧光蛋白时，固定时间不宜过久〔5〕。细胞构造抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇或甲醛固定可得到较好的结果；细胞膜相关组分抗原一般用甲醛或多聚甲醛固定；细胞器和细胞颗粒内的抗原一般用甲醛或多聚甲醛固定，并需要进展通透以使抗体能到达抗原表位。2、通透通透的目的：在细胞膜上打孔便利抗体进入，只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，由于抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。假设待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进展通透。假设所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进展通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时不需要通透处理。甲醇同样具有通透作用，但有些抗原对甲醇格外敏感，所以选择通透剂必需充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。常用的通透剂多为去污剂，如Triton、NP-40以及Tween20、Saponin、DigitoninLeucopermTriton和NP-40属于烈性去垢剂，可局部溶解细胞核膜，因此格外适合核抗原检测。但是假设在高浓度下使用或者作用时间过长，也会破坏蛋白。TritonX-100作为最常用的通透剂可以破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原的通透处理。Tween-20、Saponin、Digitonin和Leucoperm要温顺得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性抗原的检测需要先通透再固定，这样可以通过通透去除很多水溶性的蛋白，大大削减免疫荧光的非特异性结合和背景噪音。3、封闭封闭的目的是削减抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1%BSA，其它可选择的封闭剂还有1%gelatin、1%bovine或与二抗种属一样的血清〔3-10%〕等。4、抗原抗体孵育荧光蛋白抗原、直接免疫荧光法中耦联有荧光素的一抗和间接免疫荧光法中的耦联有荧光素的二抗在孵育的时候必需留意避光。为了保证抗原抗体结合的质量和防止枯燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进展。温度高可以加快抗原抗体结合速度，但也会增加非特异性结合，通常4℃过夜，以尽可能削减背景噪音。5、封片常规的方法是承受指甲油、甘油或中性树脂封片，为了增加荧光信号和延长荧光素的寿命需要在封片时添加特别的抗淬灭剂。6、样品保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此样品免疫荧光染色之后应马上观看，加有抗淬灭剂的样品在4℃存放一个星期左右，荧光信号没有太多衰减。也可以在样品固定后低温保存，需要时再进展免疫荧光。试验目的：了解并把握免疫荧光的根本原理和操作方法把握荧光显微镜的操作方法试验器材：荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、Hela细胞、耦联有荧光素的鬼笔环肽〔6.0μM〕、DAPI〔0.1μM〕、PBS、2％的甲inPBS、0.1%TritonX-100inPBS、抗淬灭剂、指甲油Hela70%PBS35min3.2%inPBS104.PBS35min5.0.1%TritonX-100inPBS〔TPBS〕76.PBS35min7.1%BSAinTPBS30minPBS35min参加耦联了Rhodamine的鬼笔环肽，37℃30min10