抗体酶教学讲解课件

抗体酶

（Abzyme)1a抗体酶

（Abzyme)1a内容抗体酶概念抗体酶产生的理论基础抗体酶的制备方法抗体酶的应用2a内容抗体酶概念2a抗体由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是多样性和专一性3a抗体由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异4a4a5a5a6a6a酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子酶反应有两个主要的特征：高催化效率、高选择性1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。7a酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子7a对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一定的能量，成为活化态或称过渡态。过渡态处于最高能阶上。过渡态与反应物的能阶之差称为活化能。获得活化能的多少与反应的速度成正比。过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论8a对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一定的能量，成过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。过渡态理论9a过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。10a与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基础上首先提出设想：能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。抗体酶设想11a1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶抗体酶的发现Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。12a抗体酶的发现Lerner和Schultz分别领导各自的研究小1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。13a1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）抗体酶抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalyticantibody)一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。14a抗体酶抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalytic抗体酶具有典型的酶反应特性与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102～106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。15a抗体酶具有典型的酶反应特性与配体(底物)结合的专一性，包括立过渡态理论与抗体酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的过渡态类似物。用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。16a过渡态理论与抗体酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡抗体酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反应有许多化学反应还没有已知酶催化进行抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体酶可以根据需要人工裁制一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。17a抗体酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反应一种对酶促反应抗体酶的催化反应类型1、转酰基反应2、水解反应3、Claisen重排反应4、酰胺合成反应5Diels-Alder反应6、转酯反应7、光诱导反应8、氧化还原反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应18a抗体酶的催化反应类型1、转酰基反应18a抗体酶的特性2、有更强的专一性和稳定性抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。19a抗体酶的特性2、有更强的专一性和稳定性19a抗体酶的制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。20a抗体酶的制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学诱导法设计半抗原选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原产生抗体。产生抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养；将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体。21a诱导法设计半抗原21a利用过渡态类似物制备抗体酶示意图22a利用过渡态类似物制备抗体酶示意图22a诱导法动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而产生的一种新方法。利用这种方法所得到的抗体酶催化效果的好坏很大程度上取决于化学模型物的设计。反应过渡态类似物，即半抗原的设计。23a诱导法动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而产生的一种新方法。抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生的单克隆抗体催化水解反应比未催化反应快104倍。酯酶催化反应的过渡态类似物设计(方框内为半抗原)24a抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原用一个带有电荷的半抗原作为免疫原，在免疫进化过程中诱异抗体结合部位的一个氨基酸残基带有互补的电荷，使其具有酸、碱或亲核催化的能力。Janda等根据此原理，以带电的半抗原1为诱导，得到7个能催化和半抗原1结构类似的底物3水解的单克隆，而结构相同但不带电的半抗原2(作为比较)却未得到有催化活性的单克隆。25a用一个带有电荷的半抗原作为免疫原，在免疫进化过程中诱异抗体结拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。26a拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物独特型每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志独特型是单克隆的，其抗原决定簇位于V区同一个体中不同B细胞克隆所产生的Ig可变区所具有的抗原特异性标志，由Ig超变区特有的氨基酸序列和构型所决定。独特型可由多个抗原决定簇组成，这些决定簇称为独特位。27a独特型每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志27a28a28a抗独特型抗体Ab2α抗Ab1V区骨架部分，具有封闭相应BCR或Ig分子的抗原结合点，抑制相应B细胞克隆的活化Ab2β抗Ab1V区CDR部分，具有类似相应抗原的分子构象，可模拟抗原与相应B细胞克隆受体结合并使之激活，故称为抗原的内影像29a抗独特型抗体Ab2α29a30a30a抗独特型抗体酶根据Jeme提出的免疫网络学说，抗独特型抗体中的Ab2β能识别并结合Ab1上与抗原表位结合的补位，其具有抗原内影像作用，可在空间结构上模拟抗原并可能具有抗原的一些性质。根据这一理论，可以酶作为免疫原诱导机体产生抗体，再利用该抗体继续免疫，诱导产生的抗独特型抗体即可能具有催化活性。利用该方法的优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体，进而产生与酶具有相同活性部位的抗独特型抗体;如果对酶的结构预先进行修饰，还有望诱导产生底物特异性与酶不同的催化性抗体。31a抗独特型抗体酶根据Jeme提出的免疫网络学说，抗独特型抗体中引入法用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备方法。将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列，以获得高效的抗体酶。对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的氨基酸顺序或对应的碱基顺序。然后通过对抗体酶结合部位氨基酸对应的基因序列进行定点突变，希望能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基酸。进而改变抗体酶的催化效率。32a引入法用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和发随着噬菌体抗体库技术的完善，可根据需要构建适当序列的基因片断，绕过免疫学方法，构建全新的抗体酶。噬菌体展示技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达，与高效快速的筛选手段结合起来，彻底改变了抗体酶生产的传统途径。用工程抗体催化法生产抗体酶，不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞，并且可筛选具有特定功能的未知结构，具有生产简单、价格低、抗体的免疫原性较低的优点，并易获得稀有的抗体。33a随着噬菌体抗体库技术的完善，可根据需要构建适当序列的基因片断Fab片断由轻链和重链的VH及CH1部分组成，作为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。从人或动物的抗原中抽取基因，然后用PCR技术重新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。这些基因库是存储在细菌病毒里，通过随机地将基因和轻重链结合的方法，就可大量制造Fab片断了。这就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体。34aFab片断由轻链和重链的VH及CH1部分组成，作为一种催化剂抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。化学修饰法35a抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。化学修饰法35a抗体酶的应用前景1、抗体酶在帮助戒毒方面的应用Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。36a抗体酶的应用前景1、抗体酶在帮助戒毒方面的应用36a37a37a抗体酶用于肿瘤治疗目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。前药(prodrug)是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。38a抗体酶用于肿瘤治疗目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（AD静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解