色谱分离技术-各种色谱分离（药物分离纯化课件）

药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--分配色谱分配色谱—色谱分离技术大纲1.分配色谱概念2.分配色谱分类3.分配色谱总结分配色谱—色谱分离技术分配色谱的固定相由一种多孔固体（如硅胶、纤维素、硅藻土等）吸附着一种溶剂构成，因此又称为液液色谱。固定相中的固体本身对分离不起作用，仅起一个支持作用，故又称为“支持剂”或“载体”。

当被分离的混合物在流动相的携带下通过固定相时，根据物质在两种互不相溶（或部分互溶）的两液体中的分配系数不同，而实现分离的方法，称为分配色谱。（一）分配色谱概念分配色谱—色谱分离技术在分配色谱中，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系同样服从分配定律。其定义式为：Kd=cs/cm；式中：Kd为分配系数；cs为固定相中的浓度；cm为流动相中的浓度

分配系数Kd越大，固定相中被分离组分的浓度越大，其保留值越大，移动速度越慢，可定性反映出色谱柱的分离效能。（一）分配色谱概念分配色谱—色谱分离技术

根据固定相和流动相之间相对极性的大小，可将分配色谱法分成正相分配色谱法和反相分配色谱法两类。

（1）正相分配色谱法的流动相极性低而固定相极性高，因此固定相对于极性强的组分有较大的保留值，常用于分离强极性化合物。（2）反相分配色谱法的流动相极性大于固定相极性，因此固定相对于极性弱的组分有较大的保留值，适于分离弱极性的化合物。（二）分配色谱分类分配色谱—色谱分离技术在强极性的流动相中加入与被测离子电荷相反的平衡离子而实现色谱分离的方法称为反相离子对色谱法。

它使用普通的反相柱，还可以进行梯度洗脱，可适用于易电离的有机化合物的分离分析，如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱等。（二）分配色谱分类分配色谱—色谱分离技术分配色谱法的分离机制、分离过程、公式、固定相、流动相、洗脱顺序等的总结归纳：（三）分配色谱法总结药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--凝胶色谱凝胶色谱—色谱分离技术大纲1.凝胶色谱概念2.凝胶色谱分离原理3.凝胶色谱分类4.凝胶色谱特点凝胶色谱—色谱分离技术凝胶色谱是利用固定相中的微孔，根据各组分分子大小的不同，来实现物质的分离，又称为凝胶过滤色谱、尺寸排阻色谱和空间排阻色谱或分子筛色谱。固定相为化学惰性多孔物质。（一）凝胶色谱概念凝胶色谱—色谱分离技术凝胶色谱分离原理如图所示。柱内装有凝胶颗粒，凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，当被分离的混合物流过色谱柱时，各组分分子存在两种运动，即垂直向下的移动和无定向的扩散运动。（一）凝胶色谱分离原理凝胶色谱—色谱分离技术由于混合物中含有大、小不同的分子，在随流动相移动时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，而是随流动相在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；

比凝胶孔小的分子以不同的扩散程度进入凝胶颗粒的微孔内，使其向下移动的速度较慢，在色谱柱中逐渐将大分子物质拉开距离，最终达到分离的目的。（二）凝胶色谱分离原理凝胶色谱—色谱分离技术凝胶色谱法主要用于分离分析相对分子质量较高（即>2000）的化合物，如脱盐、分级分离和分子量的确定等。脱盐是分离大小不同的两类分子的操作，如无机盐与生物大分子。

（三）凝胶色谱应用凝胶色谱—色谱分离技术分级分离是将分子大小相近的物质分开。对于球形蛋白分子，在排斥极限和渗透极限之间，保留值与相对分子质量的对数之间存在线性关系，据此可测定相对分子质量。（三）凝胶色谱应用凝胶色谱—色谱分离技术采用凝胶色谱法，能简便快速地对分子量相差较大的混合物进行分离；对于复杂的未知样品，可采用凝胶色谱法进行初步分级分离，无需进行复杂实验，就能获得样品组成分布方面较为全面的概况。（三）凝胶色谱应用凝胶色谱—色谱分离技术凝胶色谱按其流动相的不同分为两大类：一类是水相系统，称为凝胶过滤色谱，其所用的凝胶是亲水性的，适用于分离水溶性化合物；

另一类是有机相系统，称为凝胶渗透色谱，其所用的凝胶是疏水性的，适用于分离油溶性的化合物。（二）凝胶色谱分类凝胶色谱—色谱分离技术

作为固定相的凝胶，其材料性质、颗粒大小、孔径、机械强度、化学稳定性及其均一性等，都对凝胶色谱分离的效果有重要的影响。

因此，凝胶的选择必须根据被分离物质分子的大小、形状和分离要求的不同，选用不同的凝胶，同时还要考虑凝胶颗粒的大小对流速、压强降和分离效果的影响。凝胶色谱—色谱分离技术凝胶色谱分离的特点：①凝胶为惰性物质，不带电荷，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和；②应用范围广，可分离从几百到数百万分子量的分子；③设备简单，易于操作，周期短，凝胶一般不需要再生即可反复适用。在生物物质分离、制药生产和科研中被广泛应用。（四）凝胶色谱分离的特点药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--亲和色谱亲和色谱—色谱分离技术大纲1.亲和色谱概念2.亲和色谱分离原理3.亲和色谱对载体的要求4.亲和色谱特点5.亲和色谱应用亲和色谱—色谱分离技术随着生物技术的深入研究，人们认识到生物体中许多大分子化合物，具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力称为亲和力。亲和色谱—色谱分离技术亲和色谱：依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有特异亲和力的生物分子，固定化后作为固定相，则含有目的产物的混合物（流动相），流经此固定相后，可把目的产物从混合物中分离出来，此种分离技术称为亲和色谱。（一）亲和色谱概念亲和色谱—色谱分离技术如图所示。（1）把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能的情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱中；（2）然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条件下，进入色谱柱。（二）亲和色谱分离原理亲和色谱—色谱分离技术如图所示。（3）这时，混合液中只有能与配基发生结合反应，形成络合物的目的物质被吸附，不能发生结合反应的杂质分子直接流出。（4）经清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件进行洗脱，使被分离物质与固定相配基解离，即可将目标产物分离纯化。（二）亲和色谱分离原理亲和色谱—色谱分离技术一般情况下，需根据目标产物，选择合适的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质（固定相）。固体粒子称为配基的载体。作为载体的物质要求：①不溶性的多孔网状结构，渗透性好；②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；（三）亲和色谱载体的物质要求亲和层析纯化蛋白亲和色谱—色谱分离技术③具有亲水性，无非特异性吸附；④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固定化；⑤抗微生物和酶的侵蚀；⑥最好为粒径均一的球形粒子。常用的载体有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年来多孔硅胶和合成高分子化合物载体正在被开发应用于亲和色谱。（三）亲和色谱载体的物质要求亲和色谱—色谱分离技术亲和配基可选择酶的抑制剂、抗体、蛋白质A、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、组氨酸和肝素等。当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用，如图中a所示。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合，如图中b所示。（三）亲和色谱载体的物质要求亲和色谱—色谱分离技术如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合，如图中b所示。（三）亲和色谱载体的物质要求亲和色谱—色谱分离技术亲和色谱专一性高，操作条件温和，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离，极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的色谱分离技术。（四）亲和色谱特点亲和色谱亲和色谱—色谱分离技术亲和色谱最初用于蛋白质，特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用于：酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。

在生物化学领域，主要用于各种酶、辅酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分离分析。（五）亲和色谱应用亲和色谱—色谱分离技术亲和色谱必须要有特异的亲和配体。事实上，不是任何生物大分子间都有特异的亲和力，也很难找到适当的亲和配体；另外，亲和色谱必须针对某一被分离物质而专门制备一种固定相，并寻找特定的色谱条件，因此亲和色谱的应用受到一定的限制。（五）亲和色谱应用药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--几种常见吸附剂的特性几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术大纲1.氧化铝2.硅胶3.聚酰胺4.硅酸镁5.活性炭6.大孔吸附树脂几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术①是一种吸附力很强的极性吸附剂。②含水量越高，吸附能力越弱。③根据含水量的多少，分为I～V级。

市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100～150目。可通过活化或者去活化得到不同活度级别的氧化铝。通常在400℃左右加热6小时，可得I～II级氧化铝。1.氧化铝几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术碱性氧化铝（pH9～10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。酸性氧化铝（pH3.5～4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。1.氧化铝几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术中性氧化铝（pH7～7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。1.氧化铝几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术

硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量。

硅胶吸附力比氧化铝弱，吸附能力与游离硅醇基的数量和含水量有关，含水量>17%则失去吸附能力，不可做吸附剂。硅胶的活化：将含水硅胶在100～110℃温度下加热30min，但温度超过500℃硅胶将失去活性。2.硅胶几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及有机金属化合物等。不适用于碱性成分的分离。市售硅胶：

2.硅胶

硅胶G（加入粘合剂煅石膏14%～22%)；硅胶F（加入了紫外光下能产生荧光的物质）；硅胶H（不含粘合剂）；硅胶GF（含粘合剂和荧光物质）；硅胶HF（不含粘合剂，含有荧光物质）；硅胶S（含淀粉）。几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术色谱用聚酰胺主要有锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。聚酰胺色谱的原理：兼具吸附色谱和分配色谱的功能。采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。3.聚酰胺几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。

为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。4.硅酸镁几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术活性炭为非极性吸附剂，其吸附规律与硅胶、氧化铝恰好相反。对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对物质表现出强的吸附能力。常用于水溶液的脱色素，也可用于糖、环烯醚萜苷的分离纯化等。5.活性炭几种常见吸附剂的特性—色谱分离技术大孔吸附树脂同时具有吸附性和分子筛性。一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性物质在水中易被极性树脂吸附。物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小，反之就大。

对非极性大孔吸附树脂来说，洗脱溶剂极性越小，洗脱能力越强。

该法可用于皂苷类成分的纯化分离。6.大孔吸附树脂药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--吸附色谱吸附色谱—色谱分离技术大纲1.吸附色谱的原理2.吸附剂与洗脱剂3.影响吸附色谱分离的因素吸附色谱—色谱分离技术吸附色谱的固定相为固体吸附剂，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力。混合物被流动相带入柱内，依据固定相对不同物质的吸附力不同，而使混合物分离的方法，称为吸附色谱法。1.吸附色谱的原理吸附色谱—色谱分离技术吸附色谱分离的关键，是固体吸附剂的性能。常用的固体吸附剂有强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭质等。根据所用吸附剂和吸附力的不同，吸附色谱可分为：

(1)无机基质吸附色谱；

(2)疏水作用吸附色谱；

(3)共价作用吸附色谱；

(4)金属螯合作用吸附色谱；

(5)聚酰胺吸附色谱等。这些色谱分离方法作用机理和作用力不同，但都可看作是可逆的吸附作用。吸附色谱—色谱分离技术

根据待分离组分的结构和性质，选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。(1)吸附剂的要求：①对样品组分和洗脱剂，都不发生化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。

2.吸附剂与洗脱剂吸附色谱—色谱分离技术③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速通过色谱柱。④材料易得，价格便宜无色，以便于观察。常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等.2.吸附剂与洗脱剂吸附色谱—色谱分离技术(2)吸附剂的活度及其调节吸附剂的活性取决于它们含水量的多少，活性最强的吸附剂含有最少的水。吸附剂的活性一般分为五级，分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ表示。数字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ～Ⅲ。向吸附剂中添加一定的水，可以降低其活性。反之，如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水，则可以增加其活性，后者称为吸附剂的活化。吸附色谱—色谱分离技术各种不同活度吸附剂的含水量如表所示:吸附色谱—色谱分离技术(3)洗脱剂：

溶剂（流动相）。流动相又称为展开剂（溶剂），它是由一种或几种溶剂混合组成，在分离过程中起到把物质从固定相上洗脱下来的作用。流动相的选择原则是相似相溶。

常用的单一流动相极性顺序如下所示：

水>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石油醚。吸附色谱—色谱分离技术(3)洗脱剂以单一溶剂作洗脱剂时，溶剂组成简单，分离重现性好，但其极性固定不变，因而洗脱能力有限，分离效果不佳。

实际操作中常采用二元、三元甚至多元溶剂组分，有时为了提高分离度，在洗脱剂中还需加入少许酸、碱，促使某些极性物质的斑点集中。吸附色谱—色谱分离技术(3)洗脱剂

①混合溶剂的极性顺序（极性依次增大）：

苯∶氯仿（1+1）→环己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙酮（95+5）→苯∶丙酮（9+1）→苯∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5）→苯∶乙醚（6+4）→环己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→苯∶乙醚（4+6）→苯∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶甲醇（95+5）→氯仿∶丙酮（7+3）→苯∶乙酸乙酯（3+7）→苯∶乙醚（1+9）→乙醚∶甲醇（99+1）→乙酸乙酯∶甲醇（99+1）→苯∶丙酮（1+1）