PCR常见问题原因分析及其对策课件

PCR常见问题、原因分析及其对策PCR常见问题、原因分析及其对策1PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略主讲内容PCR技术简介PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR2PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶PCR标准反应体系3反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度

蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性

模板降解会导致PCR扩增无产物浓度

加量过多导致非特异性扩增增加特异性

长度适当、避免二级结构和二聚体完整性

避免反复冻融浓度

应适当,过高导致非特异性增加,过低则引物扩增产物太少反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等4反应体系对PCR扩增的影响反应Buffer

pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当避免反复冻融ddH2OpH值适当避免污染反应体系对PCR扩增的影响反应BufferpH值,盐离子浓5PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液Mg2＋dNTPddH2O

耐热聚合酶PCR标准反应体系6如何选择最合适的DNA聚合酶

DNA聚合酶的特性

PCR实验的不同需求如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PC7如何选择最合适的DNA聚合酶－－DNA聚合酶的特性纯度稳定性酶活性如何选择最合适的DNA聚合酶纯度稳定性酶活性8如何选择最合适的DNA聚合酶－－PCR实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒

扩增效率

保真性

特异性基因组扩增、RT-PCR基因筛选、测序、基因克隆复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶长片段扩增PCR试剂盒扩增效率9特异性－热启动Taq酶原理

蜡封抗体抑制化学修饰特点

避免非特异性扩增提高PCR反应的特异性用途

基因组扩增

RT-PCR特异性－热启动Taq酶原理蜡封特点避免非特异性扩10－热启动Taq酶特异性产品类型产品名称产品性能化学修饰

天为时代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:Thermo-start®DNAPolymeraseStratagene:SureStart™Taq

大大提高PCR反应的特异性化学修饰不影响后续实验抗体抑制

Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum®

TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion

蜡封

Promega：TaqBeadTM

HotStart－热启动Taq酶特异性产品类型产品名称11保真性—高保真酶原理用途

3’－5’核酸

表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）外切酶活性降低碱基错配率保真性—高保真酶原理用途3’－5’核酸表达基因的克12保真性—高保真酶产品类型生物公司性能比较PfuDNAPolymerase

天为时代StratagenePromega在目前已发现的所有耐热聚合酶中,Pfu保真度最高碱基错配率最低PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega保真性—高保真酶产品类型生物公司性13

高保真＋

高扩增效率原理混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用途超长片段扩增

－测序

－构建基因图谱复杂模板扩增－GC含量高－二级结构高保真＋高扩增效率原理14

高保真＋

高扩增效率特点产品性能高扩增效率天为时代：TaqPlusTaKaRa：ExTaqTM

复杂模板扩增高保真天为时代：TaqPlatinumInvitrogen：PfxPlatinumTaqHighFidelity

保真度低于Pfu聚合酶但扩增效率较高

长片段扩增天为时代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：ElongaseAmplificaitonSystem

特别适用于保真度较高的超长片段扩增高保真＋高扩增效率特点15PCR

MasterMix原理预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂

PCRMasterMix原理预配好的PCR反应液16PCR

MasterMix特点

快速简便减少加样误差和污染

灵敏度高

可扩增低至2个拷贝的目的模板

特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性

稳定性好长期放置活性无改变适用范围大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本

GC含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。PCRMasterMix特点快速简便减少加样17PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR18PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性19PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低原因对20PCR常见问题之二

非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条21PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

非特异性扩增PCR常见问题之二引物特异性差原因对重新设计引物或者使用巢22PCR常见问题之三

拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12PCR常见问题之三拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态23PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

拖尾PCR常见问题之三模板不纯原因对纯化模板拖尾24PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)25PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略提高PCR反应特异性的策略PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR26巢式PCR（Nest-PCR）四种策略

递减PCR（TouchDownPCR）

热启动PCR（HotStartPCR）

使用PCR增强剂巢式PCR（Nest-PCR）四种策略递减PCR（Touc27策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。

策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4巢式28策略之二递减PCR（TouchDownPCR）

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。

特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之二递减PCR（TouchDownPCR）递减PCR29策略之三热启动PCR（HotStartPCR）

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；

现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使