血涂片及骨髓涂片的制片与读片

PAGEPAGE4血涂片及骨髓涂片的制作与读片潘志强2006-3-30实验准备一．器材：载玻片：每只动物一块盖玻片：每只动物一块滴管：4个橡皮吸头：4个中号镊子：4把大剪刀：4把眼科镊：4把玻璃棒：4根烧杯：1000ml，2个量筒：100ml、500ml、1000ml各一蜡笔棕色小口瓶碾钵载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。二．试剂：瑞氏染液240ml瑞氏染料粉剂0.1g纯甲醇（AR）60ml将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。染料存放越久，染色效果越好。磷酸盐缓冲液1%KH2PO430ml1%Na2HPO420ml加蒸馏水至800ml，调PH值到6.5~7.0，定容至1000ml。甲醇鸡蛋清：蒸馏水与鸡蛋清按1/1的比例稀释。中性树胶：如果中性树胶过于粘稠，可将中性树胶与二甲苯按7/3的比例稀释。二甲苯

实验步骤一．涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。（6）每只动物涂片一张。（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。（8）置30min～1hr后较利于观察红细胞的形态。注意事项：如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30°而是35°～40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。如用力过猛白细胞容易破损。（二）骨髓涂片的制作用手术剪刀剪掉大腿部的肌肉，充分暴露股骨，再用大剪刀从上端剪断第2股骨，用中号镊子夹股骨以挤出骨髓，如果骨髓不易取出，可用直头眼科镊插入骨髓腔挑出骨髓，置骨髓于一载玻片上，由于骨髓液的纤维蛋白原含量较高，易于凝固，可先在骨髓液内加5~10倍的稀释后鸡蛋清，充分混匀，取1滴至另一载玻片上，涂片。涂片方法同血液涂片，但推片要快并迅速使之干燥。每只动物涂片一张。二．染色（一）血液涂片的染色（1）将待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1～3分钟。（3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色5～10分钟（白细胞数多或骨髓标本时间应长一些，如20～30min）。（4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。（5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。（二）骨髓涂片的染色同血液涂片。实验结果1．数码拍照（1）依次在低倍（×10）、高倍（×40）、油镜（×100）下观察红细胞、白细胞以及血小板正常与异常的变化。（2）用数码相机拍摄不同倍数下的细胞照片。（3）输入电脑，比较分析各组间的差异。红细胞呈桔红色，白细胞核紫色，嗜酸颗粒细胞鲜红色，嗜碱颗粒细胞蓝紫色，中性颗粒细胞紫或紫红色，淋巴细胞及单核细胞浆蓝灰色，血小板紫色。2．注意事项：1．染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。2．染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。3．细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。4．保存过久的细胞涂片，细胞染色会退色，可重新染色。5．新鲜涂片应立即染色。参考文献1．杜卓民主编.实用组织学技术.第二版,北京.人民卫生出版社,19982．徐叔云,卞如濂,陈修主编.药理实验方法学.第三版.北京.人民卫生出版社,20023．丛玉隆,乐家新,秦小玲,等主编.血细胞分析技术与临床.天津:天津科学技术出版社,2002.4附3：血液涂片和骨髓涂片的观察内容血液涂片：选择10个视野，每个视野内红细胞的数量大致相同，观察红细胞的排列、分布及形态，白细胞的数量及核的变化。骨髓涂片：全面观察成熟红细胞与有核细胞的大致比例，以确定增生度。分级标准见表：级别增生度成熟红细胞/有核细胞常见原因Ⅰ增生极度活跃1~2/1白血病Ⅱ增生明显活跃10/1白血病、增生性贫血