河南省农户小麦存售粮行为调查分析及转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

河南省农户小麦存售粮行为调查分析 摘要：本文利用20XX年河南省农户调查数据来分析农户小麦存售粮行为。研究发现，农户小麦存售比率下降，小麦消费市场化程度提高，自给自足的传统农业正向以市场化为表征的现代农业方向快速演化。影响农户小麦存售行为的因素有农户家庭人口规模、人均非农收入和户主年龄。人口规模大的家庭，存多售少。人均非农收入高的农户存麦低于人均非农收入低的农户。年轻的新型农民存粮显著低于年龄大的传统农民。综合这些观察，可以预测未来中国粮食市场规模会大幅度提高，这需要调整国家粮食储备、市场流通、粮食贸易等相关政策，以适应粮食快速市场化的新形势。关键词小麦河南存售粮行为粮食安全新型农民(一)研究背景传统小农耕作以满足自家消费为目的，粮食等农产品市场化程度低，存售比率高。随着上世纪80年代农业改革的逐步推进，在中国粮食产量逐年增加的同时，非农收入在农户家庭收入中所占比重不断提高，大量农村劳动力流向城市，原来许多种粮农户粮食消费也越来越多地需要通过市场购买，这势必影响到中国粮食市场规模和结构。近年来，国际粮食市场深度动荡，国内CPI居高不下，就需要更加充分调查研究农户的存售粮行为，为国家制定粮食政策提供重要参考。柯炳生（1997）较早关注了中国农户粮食储备的影响因素及其对市场的影响，认为农户储粮的基本动机是出于粮食安全考虑。粮食政策、市场风险和不稳定的气候条件使农户采取措施储粮，农户储备粮水平变动只有20%-30%与市场价格变动相关。Park(1999)认为在市场缺乏效率和市场不完全的情况下，交易成本最小和消费安全是农户粮食储备的决定因素。万广华等（2007）利用中国1992～2002年间27个省（市、自治区）的面板数据检验了农户价格投机、交易成本和消费安全三个方面对农户粮食储备量的影响，发现影响农户粮食储备行为的因素包括价格和消费安全考虑而不是交易成本。史清华和徐翠萍（2009）通过对长三角15个村1000个农户的调查发现，过去20年里农户粮食储备出现了明显的倒∪型特征，农户年储粮只有3个月的消费量，农户的粮食需求对市场的依赖程度越来越高。已有研究为分析农户粮食存售行为提供了重要参考，但还不足以认识当前我国农户粮食生产和消费行为出现的新情况、新特征。本文利用我国农业第一大省河南省2011年5个小麦主产县农户调查数据，应用Probit和Logit模型解释农户小麦消费市场化的原因，并用线性模型估计了小麦存售比率和存量的影响因子的弹性。发现家庭人口规模大的农户存售粮比高、人均非农收入高的和户主年龄小的农户存粮少，粮食价格不是决定农户存粮规模的根本原因，而年龄是影响农户存售粮比率最为主要的因素。（二）理论和样本点分布1.农户存售粮行为的理论分析市场交易者的商品储备行为常用价格套利理论来解释，通俗来说就是市场交易者低进高抛。如果市场交易者选择在某一时期增加或减少商品储备，影响其行为的方程为：………(1)式中，Pt为t期价格，C为商品存储边际成本，E（Pt+1）是商品预期价格，r为市场利率。根据Nerlove（1958）的适应性预期理论，价格形成表现为一个适应性预期过程，可表达为：……………(2)其中，Pt表示t期商品价格，表示滞后期的价差，r是对过去价格变动的一个调整系数。但Renkow(1990)发现经典的商品储备套利模型不适合半自给农户的粮食储备行为。如果将农户粮食消费完全通过市场购买看作自给自足的传统农业向以市场化为特征的现代农业完全转型，而部分粮食消费通过市场购买视为传统农业向现代农业的过渡。将完全依赖于市场的粮食消费的农户定义为1，部分依赖于市场的农户定义为0，可用Probit或Logit两种离散因变量模型来估计一个农户粮食消费从半自给自足向完全市场化变动的影响因素和概率。Probit模型的数学式表示为：…….(3)其中，为标准正态分布函数，β为待估计参数，X为影响农户粮食消费是否完全市场化的向量指标，包括：1）农户家庭常住人口；2）农户户主和其他家庭成员的年龄；3）家庭常住人口在家的居住时间；4）小麦市场价格；5）农户人均非农收入；6）是否村干部和县级区域虚变量。借鉴已有的研究，定义农户小麦存售行为方程：…..(4)其中：St表示t时期农户小麦存量，TPt为农户当年小麦产量；Pt为当期价格，X3为农户特征向量，X4是人均非农收入；D是否村干部和县级区域虚变量，是随机扰动项，a为截距项，b为待估参数。2.样本点分布河南省是我国粮食产量第一大省。2009年，全国小麦产量1.15亿吨，河南省小麦产量达到了3156万吨，占了全国的26.5%，调查分析河南省农户小麦存售行为具有代表性。课题组在2011年7月20-30号选取河南省郑州市的中牟县和新郑市、焦作市的修武县和沁阳市、新乡市的延津县等5个小麦主产县，分别代表豫东中筋、强筋白麦种植区、豫西北强筋白麦种植区和豫东北强筋、中筋白麦种植区。每个县选取7个村，每个村随机选取10户，共计35个村，350户农户，以农户和村级问卷的方式实地调查。受各种因素制约，实际得到的有效问卷336份。表2-1样本点分布情况郑州市焦作市新乡市中牟县新郑市修武泌阳延津村名户数村名户数村名户数村名户数村名户数坡刘村10敬楼9小营村9西向二街9梁僧固10冯庄村9北靳楼10杨楼村10大金陵9位庄10皛店村10东郭寺10西黄村10皮庄10青庄8丁庄村9岳庄9王村9小金陵10王潭村10贺兵马村10姚张村9郇封村10廖屯10军寨村9芦家村10沂水10小文案10屯头10李僧固10三王村8史庄10马庄9袁屯9李庄9资源来源：作者整理（三）数据分析336份有效样本中，36户家庭没有种植小麦，61户在小麦收割完后不到10天内将小麦全部出售，216户在小麦收割完后销售一部分，然后留存一部分满足自家消费，23户没出售小麦。也就是说，调查农户中有97户小麦消费全部通过市场购买，占总户数的30%。特别是郑州市的中牟县，大蒜等经济作物占农户农作物播种面积比例大，农户主食消费对市场的依赖度更高，几乎一半的农户需要全部从市场购买面粉、馒头、面条、油条、烧饼、饺子、面包等当地人习惯消费的主食。在其它小麦主产县，小麦生产消费完全市场化的农户也占了一定比例。表3-2农户小麦存售情况样本县没种小麦收割完后一次性售完收割完后销售一部分收割完后不出售总户数中牟县246241266新郑市21253370修武31843367泌阳7849367延津01747266合计366121623336资料来源：作者调查理论上说，如果家庭人口在家居住时间越长，主食消费量越大，农户小麦主食消费完全市场化的概率变小。经统计检验，这个变量与农户人均非农收入高度负相关。原因可能是农户家庭人口在家居住时间越长，外出非农就业时间就越短，农户的非农收入随之显著下降。根据AIC和SIC准则，在参数估计时将这个变量去除掉。县域虚变量中牟县样本定义为0，其他县的定义为1，表示气候、消费习惯、基础设施等区域性差异。表3-3农户小麦消费市场化的Probit和Logit模型估计结果解释变量Probit模型弹性值Logit模型弹性值家庭人口数（人）-.1589*-0.249-.2679*-0.234小麦单价（元/斤）0.38540.1270.66560.122人均非农收入（元）.000034*0.066.00006*0.065户主年龄（岁）-.0258*-0.469-.0432*-0.438是否村组干部（是=1）.4758*0.0410.8123*0.039户主受教育年限（年）-0.0194-0.054-0.0384-0.060县域虚变量(新郑)-0.0601-0.005-0.1031-0.005县域虚变量（修武）0.43810.0330.73700.031县域虚变量（泌阳）-0.2494-0.017-0.47860.019县域虚变量（延津）0.49650.0390.84130.037常数项0.56160.9620LRchi2(10)30.8630.36Prob>chi20.00060.0007注:*、**、***分别表示在5%、1%和0.1%置信度下显著估计结果正如所预计的一样，不管是用Probit模型或是Logit模型，农户小麦消费是否完全市场化显著地受农户家庭常住人口规模、人均非农收入、户主年龄的影响。农户家庭人口规模越大，存粮来保障自已粮食安全的概率越高，其弹性为-0.249（Logit模型估计结果为-0.234）；小麦的价格不是农户小麦消费全部市场化的决定性因素。随着价格上涨，农户售粮增加，市场化程度提高，但出于保障自身粮食安全的考虑，价格提高并不会使农户将粮食安全全部推向市场。随着经济发展，农户人均非农收入的大幅度提高，农户小麦消费完全市场化的概率也相应提高，虽然弹性值仅为0.066。农户人均非农收入完全市场化的弹性值较低，表明即使农户非农收入增加，农户也会选择保存一定量的粮食。然而，随着非农收入的持续增长，将会有更多的农户粮食消费全部通过市场购买。比如，若农户人均非农收入翻番，农户小麦消费完全市场化的概率将提高7%。特别值得关注的是户主的年龄与农户小麦消费是否全部市场化高度负相关，表明年轻的农民粮食生产消费的市场观念要高于年龄大的农民，其弹性值为-0.469。也就是说，平均意义上讲，1980年出生的农民存粮的概率比1960年出生农民存粮的概率下降10个百分点。就心理认知而言，20世纪80年代以后出生的农民，对饥饿、灾荒的危害程度的理解没有他们上辈那些人深刻，这些农民参与市场的程度更高，对粮食不安全风险的预期低。农户生产小麦后，一部分用于销售，一部分用于储备（主要用于一个市场周期内的自家消费）。用农户小麦销售量占生产量的比例（Rstock）来反映农户小麦生产市场化程度，小麦生产量与销售量的差(Gstock)反映农户出于自家粮食安全考虑后的小麦储备行为，并用这两个变量分别对家庭人口数量、小麦出售价格、人均非农收入、户主年龄、文化程度、是否村组干部以及县级地区虚变量进行普通最小二乘（OLS）回归，结果如下：表3-4小麦存售行为的影响因素（OLS估计）RstockGstock解释变量系数（t-值）弹性值系数（t-值）弹性值家庭人口数（人）-.0172*(-2.42)-0.10133.451***(3.82)0.58小麦单价（元/斤）.6411***(8.75)0.80-167.434(-0.47)-0.15人均非农收入（元）4.519e-06*(2.34)0.03-0.019*(-2.02)-0.10户主年龄（岁）-0.0020(-1.67)-0.1412.001*(2.04)0.61是否村组干部（是=1）.0576*(2.27)0.02-52.440(-0.42)-0.01户主受教育年限（年）0.0030(0.68)0.03-5.421(-0.25)-0.04县域虚变量(新郑).1069**(2.78)0.03-479.428*(-2.55)-0.11县域虚变量（修武）0.068(1.74)0.02-409.13104*(-2.14)-0.09县域虚变量（泌阳）0.015(0.36)0.00-71.741(-0.36)-0.01县域虚变量（延津）.1628***(4.25)0.05-556.472**(-2.97)-0.12常数项0.1965(1.84)474.267(0.91)F(10,270)13.124.52可决系数（R2）调整可决系数0.32710.30220.14350.1118注:*、**、***分别表示在5%、1%和0.1%置信度下显著两个方程的F统计量值分别为13.12和4.52，大于1%水平下的F临界值，拒绝H0假设，方程总体显著、有效。两个方程回归的可决系数分别为0.32和0.15，作为利用横截面数的估计结果，是可以接受的。回归结果显示各变量的符号与理论预期相符合。家庭人口规模越大的农户，小麦销售量占产量的比例越小，农户存粮越多，对自身粮食消费的关注程度越高。就小麦存储量而言，价格提高，存储量减少，销售量增加，但系数在统计上并不显著。原因是随着小麦价格提高，如果农户小麦产量高，在能够首先满足自家消费的情况下，农户会相应提高小麦销售量占小麦产量的比重。不管如何，农户的年龄是影响其小麦销售和储备行为的重要因素。年轻的农民更愿意增加售粮、减少储存，更多地到当地市场上购买馒头、面条等劳动节约型的主食品。人均非农收入水平的提高，使得农户从市场上购买食物的能力增强，也会促使农户减少存粮；此外，人均非农收入高的农户，用于存储粮食的劳动力机会成本高，这也是农户减少存粮、增加销售量的重要原因。特别地，按照预期理论，在市场信息不完全的条件下，农户常会“价涨时惜售、价落时抛售”，但调查结果并不支持这种理论假设。调查区域小麦收割时间在6月10号前后，高达87%的农户在收割完小麦的1个月之内将所需出售的小麦全部售完。90%以上农户选择在家将粮食销售给粮食经纪人。近年来消费者食品价格指数（CPI）逐年提升，通货膨胀率高涨，一些研究将其归结为农民对通胀的预期（马龙等2010）。从小麦主产区农户售粮行为看，并没有出现农户在价格上升时“捂粮不售”的情况。就单个农户页言，其销售粮食的总量较小，很难对粮食市场价格变动有一个精确预测，如果农户有很强的通胀预期，其应会选择多次售粮，而不是一次性售粮。在国家逐年提高小麦最低收购价格的情况下，小麦价格的增长表现出一个平稳、缓慢的态势，农户价格上涨预期不大。如表3-5所示，各县小麦价格与中国粮食储备总公司在河南的小麦收购价变动基本相同。表3-52009年7月以来调查村小麦价格（元/斤）调查县2009M72009M122010M72010M122012011M7中储粮收购价0.870.870.900.900.950.95中牟县0.920.940.971.031.031.01新郑市0.890.910.940.990.991.00修武0.900.940.981.021.021.01泌阳0.850.890.940.981.011.02延津0.900.920.960.991.011.00平均0.890.920.961.001.011.01资料来源：作者调查注：M表示月份现阶段农民存麦的容器五花八门，有用化肥塑料袋、橡胶麦屯、铁皮麦屯、塑料粮仓、布袋、瓷缸等等，但化肥塑料袋作为存储容器所占比例最大。因其容量100斤易搬运和存放，成本很低。农户在存粮袋里放少量驱虫药，然后存储在一间专门用于存放粮食的小房间里。他们认为这种存放方式基本不会有虫蛀、霉变等损耗。调查发现，有部分村的农民直接将收获的小麦存放在当地面粉厂，面粉厂按一定面粉折换率（一般为0.7-0.8。折换率高低取决于小麦质量、麦麸归农民还是面粉加工厂）给农户面粉。这种方式既保障了农民的口粮安全，又可节约农户的存储和交易成本，值得推广。此外，由于农民居住坏境和生活方式较之以往有了变化，很多两层或两层以上楼房的农户，也会减少存粮数量。（四）结论和讨论根据对河南省农户小麦存售粮行为的调查分析，农户小麦生产消费市场化程度提高，越来越多的自给、半自给的传统小农向市场化的现代农户生产消费方式转变。农户小麦生产消费市场化程度取决于家庭人口规模、户主年龄和人均非农收入水平，小麦价格并不是根本原因。年轻农民存粮明显下降，随着1980后出生的新型农民成为农业生产的主力军，农户家庭规模缩小，农户非农收入来源的增加，未来中国粮食生产、消费的市场化程度会进一步加快，这会大大提高小麦等粮食作物的市场规模，势必影响到全国小麦市场流通的空间布局、国家粮食储备和贸易政策。在农户粮食生产消费市场化程度提高后，如何平衡市场与国家粮食储备在调控粮食市场特别是如小麦这样的主食品价格的关系值得讨论。小麦等粮食作物生产依赖于光、温、水、土等自然条件，生产具有周期性，而小麦等粮食是人类最为主要的食物营养来源。世界各国都通过粮食储备来解决粮食生产与消费之间的时间差矛盾，如FAO提出了粮食库存警戒线(库存消费比)为17%~18%（约需有65天粮食消费量的储备量）。对于一个国家粮食储备制度、数量大小以及对市场价格波动的平抑作用，学者们还存在较大分歧。有的认为，尽管粮食储备可以吸收生产和市场的短期波动并保持供应和价格稳定，但也可能延缓市场价格的信号作用，把本来不严重的短缺倾向积累成巨大的波动。有的认为适当的价格干预是利大于弊，政府应积极制定调控粮食市场的政策。由于世界各国的粮食自给能力不同，就粮食储备规模、政府储粮所占份额而言，粮食储备主要有以美国、加拿大、法国为代表的低政府粮食储备规模和以中国、印度、韩国、日本等国为代表的高政府粮食储备规模两种类型。一般认为，通过市场方式进行粮食储备，资源利用率高，但遇到粮食供求失衡严重的年份，容易引起市场价格的大幅度波动，存在较大的社会风险，而政府主导粮食储备的方式，效率低，财政负担沉重。因此，在中国农户粮食生产消费市场化日益提高、传统小农向现代农户转型的今天，需要根据我国的实际情况，找到一个能充分发挥市场和政府各自作用的粮食市场健康运行的平衡点。参考文献柯炳生：《中国农户粮食储备及其对市场的影响》，《中国软科学》，1997.5Park,A.:HouseholdGrainManagementUnderUncertaintyinChina’sPoorAreas,PhDthesis,Stanford万广华和张藕香:《中国农户粮食储备行为的决定因素：价格很重要吗？》，《中国农村经济》，2007.5史清华和徐翠萍：《农家粮食储备：从自我防范到社会保障-来自长三角15村20年的实证》，《农业技术经济》，2009.1Nerlove,M.:AdaptiveExpectationsandtheCobwebPhenomena,QuarterlyJournalofEconomics,73（2）:227-40,1958Renkow,M.:HouseholdInventoriesandMarketedSurplusinSemi-subsistenceAgriculture,AmericanJournalofAgriculturalEconomics,72:664-75,1990；马龙和刘澜飚：《货币供给冲击是影响我国农产品价格上涨的重要原因吗》，《经济学动态》，2010.5转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗病性鉴定王金凤1,2，李钊2，杜丽璞2，黄素萍1,2，徐惠慧君2，冯斗1，张增艳2*（1广西大学农学院,南宁530004;2中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类作物生物和遗传改良重点实验室,北京100081）摘要:多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白，可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvPGIP2基因编码序列，构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2；采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块，获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株，转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1-T2代植株，进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明，转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达；PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。关键词：PvPGIP2基因；转基因小麦；小麦纹枯病；抗性DevelopmentandCharacterizationofPvPGIP2TransgenicWheatPlantswithEnhancedResistancetoRhizoctoniacerealis（1CollegeofAgronomy,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530004;2NationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovement/KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofTriticeaeCrops,MinistryofAgriculture/InstituteofCropSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081）Abstract：Polygalacturcuase-inhibingproteins(PGIPs)aredefenseproteinsproducedinplants,whichcaninhibitthegrowthofpathogenicfungi.Inthisstudy,thecodingsequenceofthebeanPGIPgenePvPGIP2wascloned,anditstransformationvector,pA25-PvPGIP2,wasconstructed,inwhichtheexpressionofPvPGIP2wasdrivedbythemaizeubiquitinpromoter.Atotalof4000embryocallusofwheatvarietyYangmai18werebombardedbytheparticlecontainingpA25-PvPGIP2,and203regeneratedplantswereobtained.ByPCRspecifictothetransgene,65positivetransgenicplantswereidentifiedintheT0generation,thusthetransformationfrequencywas1.625%.ThetransgenicwheatplantsinT1-T2generationsweresubjectedtoPCR,RT-PCR,andQ-RT-PCRanalyses,anddiseaseresistanceevaluationfollowinginoculationswithRhizoctoniacereali.TheresultsshowedthattheintroducedalienPvPGIP2geneinthesetransgenicwheatplantscouldbeinherited,andexpressedinthewheatplantscouldbeinheritedandexpressedinthewheatbackground.收稿日期：基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08002-001，2009ZX08002-006B)作者简介：王金凤，硕士研究生，主要从事小麦抗病分子育种研究；通讯作者:冯斗，副教授，主要从事作物遗传育种和基因工程教学与研究；张增艳,研究员，博士生导师，主要从事小麦抗病分子生物学与分子育种研究，E-mail:zhangzy@ThetransgenicwheatplantsexpressingPvPGIP2showedenhancedresistancetoR.cerealiscomparedwithuntransformedYangmai18.Keywords:PvPGIP2gene;Transgenicwheat;Rhizoctoniacerealis;Resistance近年来，随着肥水条件的改良、种植密度增加和耕作制度的改变，加之生产上大面积推广品种对纹枯病的抗性普遍较差，土传病害小麦纹枯病已成为我国小麦高产稳产的主要限制因素之一。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病（wheatsharpeyespot），是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的AG4和AG5融合群引起的。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)[1]。小麦纹枯病主要侵染小麦的基部叶鞘和茎秆，造成植株倒伏、枯死和白穗，导致小麦产量严重损失，一般地块小麦减产10%~30%,严重地块减产超过50%[2]。化学药剂防治的效果较差。选育和推广抗病小麦品种是控制上述病害最为经济、有效和安全的措施。因此，发掘、利用重要的抗病相关基因,开展抗纹枯病小麦基因工程研究非常重要。真菌多聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase,endo-PG）是植物细胞壁降解酶，在真菌、细菌和线虫等侵染植物的过程中起着重要作用[3-5]。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturcuase-inhibitingprotein,PGIP）是一种能够抑制病原菌endo-PG活性的细胞壁蛋白[6]，富含亮氨酸重复（LRR）结构7]，一般包含9~10个LRRs,每个LRR由24个氨基酸残基组成，形成2个β-sheet,其中sheetB1形成一个内部凹陷，特异性识别endo-PG[8-10]。现已证明PGIP在植物体内具有防御作用[6],可以减少病原原菌endo-PG对植物细胞壁的降解，使植物细胞壁不易被病原菌分泌的水解酶所渗透，阻止病原真菌的侵染[11]。迄今己有多种抗性相关的植物PGIP基因被克隆[12]，对其在植物抗病中的作用以及应用进行了研究[13-15]。Cervone等[15]发现多种豆类中PGIP对真菌endo-PG具有广谱抗性。Frediani等[16]发现菜豆PGIP2基因与其他3个基因（PvPGIP1,PvPGIP3和PvPGIP4）位于B2连锁群上[17]，其中PvPGI2蛋白可抑制多种病菌endo-PGs，具有广谱性抑菌作用[10,18]。本研究利用基因工程技术成功构建了PvPGIP2基因的单子叶植物表达载体pA25-PvPGIP2，用基因枪法将该载体转入小麦推广品种扬麦18，对转基因小麦T0-T2代材料进行分子检测和抗病鉴定，分析PvPGIP2基因在转基因小麦中的表达水平和纹枯病抗性,以期明确转PvPGIP2基因小麦的纹枯病抗性功能及其应用前景。1材料与方法1.1材料小麦品种扬麦18，由江苏里下河农业科学研究所小麦育种组提供。菜豆（Phaseoulsvulgaris）英国红种子由中国农业科学院作物科学研究所宗绪晓研究员提供。质粒pAHC25由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种组保存；限制性内切酶SmaⅠ、SacI和TaqDNApolymerase、T4DNApolymerase购自大连宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞Top10菌株、琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒小量提取试剂盒,购自北京天根生物技术公司。Ampicillin(Amp.)购自北京拜尔迪公司。引物由北京奥科生物技术公司合成。1.2方法1.2.1P利用TRIZOL试剂（Invitrogen公司）提取菜豆英国红的叶片总RNA。用RNAPCRkitver.3.0试剂盒（Takara）合成第一条链cDNA。以该cDNA为模板，按照PvPGIP2（FM253101）和Sun等[19]公布的EST序列（DN551584）序列，设计1对基因特异引物PvPGIP2-U:5′-GCAACCATGTCCTCAAGC-3′和PvPGIP2-L:5′-ATGATTAAGTGCAGGCAGG-3。采用TaqplusDNA聚合酶（Takara）和PCR反应标准体系，扩增得到1012bp的PvPGIP2基因产物，回收、纯化，克隆于载体pMD18-T（Takara），测序分析。结果表明，所获得的DNA片段上包含PvPGIP2的完整编码序列（ORF）。为构建转基因表达载体，设计引物(PvPGIP2-OF:5’-GACCCGGGATGTCCTCAAGCTTAAGC-3’，引入SmaI酶切位点,PvPGIP2-OR:5’-CACTCGAGAGTGCAGGCAGGAAGAGG-3’，引入SacI酶切位点)进行PCR扩增。消化该pAHC25，回收所需片段,利用T4连接酶将SmaI、SacI双酶切的PvPGIP2基因ORF连接到SmaI、SacI酶切处理的pAHC25载体上,构建成PvPGIP2基因的表达载体pADigestedbyDigestedbySmaIandSacI,andrecoveredthetargetDNAfragmentT4ligaseDigestedbySmaIandSacI,andrecoveredthetargetfragment图1PvPGIP2基因转化载体pA25-PvPGIP2构建流程Fig.1ConstructionofpA25-PvPGIP2expressionvector1.2.2基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织及植株再生利用徐惠君等[20]报道的基因枪轰击法，将pA25-PvPGIP2表达载体和适量的金粉混合后，转化小麦品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块，通过筛选、分化、再生、移栽成苗等步骤，进而获得转pA25-PvPGIP2基因小麦扬麦18的T0代植株。1.2.3采用改良CTAB法[21]提取再生植株基因组DNA，作为转基因小麦PCR检测的模板。根据转PvPGIP2基因载体的序列设计引物(PvPGIP2-1910U：‘-GCTCTGCCTTCATACGCTA-3’和PvPGIP2-2381L：5‘-TGGGTGAGTTTAGCGATGG-3’)。。用扬麦18为阴性对照，质粒pA25-PvPGIP2作为阳性对照，预期从转基因载体质粒和转基因小麦扩增片段大小约为471bp。1.2.4PvPGIP2以第一链cDNA为模板，首先用小麦Actin基因特异引物(ACT-A：5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3';ACT-B：5'-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3')作内标，均一化各样本cDNA模板量。用PvPGIP2基因特异的引物(PvPGIP2-QU：5'-ACTCTGCTTTTGGTCACTCTTG-3';PvPGIP2-Q-R：5'-TACCATAAGTTCCAGAAGGCAC-3')进行半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析。1.2.5纹枯病的抗性鉴定参考蔡士宾等[22]报道的牙签菌接种法，在小麦分蘖盛期，用消毒镊子夹取长满禾谷丝核菌R0301菌丝的牙签段，轻轻地嵌入麦苗叶鞘内，每个叶鞘嵌入一个有菌牙签段，至少保湿3d，于小麦收获期对单株进行抗病调查，小麦纹枯病的鉴定采用蔡士宾等[22]的0级至5级分级方法，病情指数用如下公式计算：式中，i表示纹枯病病级，Xi分别表示病级为i级的茎秆数。2结果与分析2.1PvPGIP2基因转化载体的构建与转基因小麦的获得由图1和测序结果可知，基因转化载体pA25-PvPGIP2构建正确，PvPGIP2受玉米泛素(ubiquitin，Ubi)启动子的控制，此载体可以在单子叶植物中高效表达。通过基因枪，将含pA25-PvPGIP2金粉子弹轰击小麦推广品种扬18幼胚愈伤组织4000个，获得203株再生植株，通过PCR检测出阳性植株65株，转化率为1.625%。2.2转基因小麦的分子检测提取转PvPGIP2基因小麦T0-T2代植株的叶片基因组DNA，作为转基因植株外源目标基因检测的模板。利用转PvPGIP2基因载体特异的引物进行了PCR检测。结果表明，每代材料均可以检测到转入的PvPGIP2基因（图2），转入的PvPGIP2基因可在转基因小麦中遗传。MPWTCK1234567891011121314MPWTCK1234567891011121314PvPvPGIP2图2转PvPGIP2基因小麦T2代植株的PCR检测Fig.2PCRanalysisonT2plantsofPvPGIP2transgenicwheatM：100bpDNAladder;P：pA25-PvPGIP2转基因载体质粒PvPGIP2transformedvectorplasmidpA25-PvPGIP2;WT未转基因扬麦18UntransformatedYangmai18，CK：ddH2O；1~14：转基因株系Transgeniclines2.3转基因小麦中PvPGIP2的转录水平利用半定量RT-PCR分析转PvPGIP2基因小麦T2代抗病植株中PvPGIP2基因的转录情况，结果表明这些抗病植株中PvPGIP2基因的转录水平高于未转基因小麦受体扬麦18。进一步利用Q-RT-PCR定量分析这些抗病植株中PvPGIP2基因的相对表达量，结果表明，抗病植株（P1、P2、P3、P4、P5和P6）中PvPGIP2基因的表达水平明显高于未转基因小麦受体扬麦18，不同植株中的表达量存在差异，表达量越高抗病性越强(图3)。图3转PvPGIP2基因小麦中PvPGIP2表达的RT-PCR（A）和定量RT-PCR（B）分析Fig.3RT-PCR（A）andQ-RT-PCR(B)assaysonPvPGIP2transcriptintransgenicwheatP1~P6:转PvPGIP2基因小麦植株PvPGIP2transgenicwheatplants；WT:未转基因的扬麦18Wild-typeYangmai182.4转基因小麦的纹枯病抗性抗病鉴定结果表明，与未转基因小麦受体相比，PvPGIP2表达的转基因小麦植株对纹枯病抗性有所提高。转PvPGIP2基因小麦T1代PCR阳性植株的纹枯病平均病级为1.74，病情指数为33.87，未转基因小麦扬18的纹枯病平均病级为2.83，病情指数为59.06。转PvPGIP2基因小麦T2代PCR阳性植株的纹枯病平均病级为1.53，病情指数为22.22-31.1431.12，未转基因小麦扬18的纹枯病平均病级为2.87,病情指数为54.12（表1）。其中6个抗病的转PvPGIP2基因小麦T2代株系P1、P2、P3、P4、P5、P6及其受体小麦的病情指数见表1。由此可见，PvPGIP2基因在小麦中的表达显著提高了转PvPGIP2基因小麦植株对纹枯病抗性。表1转PvPGIP2基因小麦T2代纹枯病病情指数与抗性（核实正文数据和表1数据的一致性）Table1DiseaseindexandresistanceofPvPGIP2transgenicwheatT2plantsagainstRhizoctoniacerealis株系Line病情指数Diseaseindex抗性Resistance扬1854.12MS扬麦15858.25MSP129.43*RP224.21**RP331.14*RP422.22**RP528.86*RP628.00*R数据为T2代转基因株系中阳性植株平均值。*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平与对照扬麦18有显著差异；MS表示中感（Mediateresistance）；R表示抗(Resistance).Dataaremeansofpositivetransgenicplantsineachline.*and**indicatesignificantdifferencescomparedwithYangmai18atP<0.05andP<0.01,respectively.补绿色阴影部分的英文？3讨论PvPGIP2蛋白是一种菜豆细胞壁蛋白，可以在体外抑制多种病原真菌的endo-PG活性，已应用于葡萄抗病育种中。针对小麦纹枯病危害日趋严重、抗纹枯病小麦常规育种进展缓慢等问题，利用基因工程方法将PvPGIP2基因转入小麦，探讨其在小麦抗病育种上应用潜力具有重要意义。本研究创制出纹枯病抗性提高的转PvPGIP2基因小麦新资源，外源PvPGIP2基因在转基因小麦中能够遗传、表达，可以提高转PvPGIP2基因小麦对纹枯病的抗性。构建了在小麦中高效表达的转基因载体，利用基因枪介导法将PvPGIP2基因转入推广小麦品种中。通过对转PvPGIP2基因小麦T0代到T2代植株中进行PCR检测和转录表达分析，获得PvPGIP2表达的转基因小麦植株；对转PvPGIP2基因小麦的T1～T2代植株的小麦纹枯病菌抗性鉴定结果也表明，PvPGIP2基因表达的转基因小麦植株对纹枯病菌抗性得到显著提高。然而，纹枯病抗性鉴定易受环境、发病条件等因素的影响,因此今后需要在该病高发区和重发区进行多年鉴定。本研究中还发现，虽然一些转PvPGIP2基因的小麦植株中可检测到PvPGIP2基因，但这些植株不抗病，可能与这些植株中PvPGIP2基因的表达量低或与其插入位点有关。另外，因转PvPGIP2基因小麦的抗病性水平中等，PvPGIP2基因应用于抗纹枯病小麦基因工程育种方面仍然不太理想，还需要挖掘更有效的抗小麦纹枯病基因进行功能分析。参考文献(英文参考文献已修改，请将黄色阴影部分改为中文参考文献)[l]陈延熙,唐文华,张敦华,等，等，我国小麦纹枯病病原学的初步研究[J]，植物保护学报，1986,l3(1)：39-44[2]路妍，张增艳，任丽娟，等.转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性[J]，作物学报，2009,35(4)：640−646[3]DeLorenzoG,FerrariS.Polygalacturonase-inhibitingproteinsindefenseagainstphytopathogenicfungi[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2002,5:1-5[4]FerrariS,VairoD,AusubelFM,etal.Arabidopsispolygalacturonase-inhibitingproteins(PGIP)areregulatedbydifferentsignaltransductionpathwaysduringfungalinfection[J].PlantCell,2003,15:93–106[5]ManfrediniC,SiciliaF,FerrariS,etal.Polygalacturonase-inhibitingprotein2ofPhaseolusvulgarisinhibitsBcPG1,apolygalacturonaseofBotrytiscinereaimportantforpathogenicity,andprotectstransgenicplantsfrominfection[J].PhysiolMolPlantPathol,2006,67:108–115[6]DesiderioA,AracriB,LeckieF,etal.Polygalacturonase-InhibitingProteins(PGIPs)withdifferentspecificitiesareexpressedinPhaseolusvulgaris[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,1997,10(7):852-860.[7]JonesDA,JonesJDG.Therolesofleucinerichrepeatsinplantdefences[J].AdvBotResAdvPlantPathol1997,24:90–167[8]LeckieF,MatteiB,CapodicasaC,etal.Thespecificityofpolygalacturonase-inhibitingprotein(PGIP):asingleaminoacidsubstitutioninthesolvent-exposedβ-strand/β-turnregionoftheleucine-richrepeats(LRRs)conferconfersanewrecognitioncapability[J].TheEMBOJ18:2352–2363[9]DiMatteoA,FedericiL,MatteiB,etal.ThecrystalstructureofPGIP(polygalacturonase-inhibitingprotein),aleucine-richrepeatproteininvolvedinplantdefense[J].ProcNatlAcadSci,2003,100:10124–10128etalDevotoA,PontiggiaD,RobertiS,GallettiR,ContiE,O’SullivanD,DeLorenzoG.CharacterizationofthecomplexlocusofPhaseolusvulgarisencodingpolygalacturonase-inhibitingproteins(PGIPs)revealssub-functionalizationfordefenseagainstfungiandinsects[J].PlantPhysiol,2004,135:2424–2435[11]TurnerJG,HoffmanRM.EffectofthePGIPfromPeaonthehydrolysisPeacellwallsbytheedno-PGfromAscochytap