液相色谱-仪器课件

高效液相色谱仪器美国Agilent美国Waters美国戴安日本岛津美国VARIAN

日本岛津德国诺尔美国LabTech大连依利特进样前准备——样品过滤一次性注射器针式〔头〕过滤器样品瓶1、注意滤膜种类〔有机/水系〕2、混合后抽滤注意有机相可能比例变小—保存时间变大，别离效果变化〔特别滤的很慢时〕。Agilent1100在线脱气机戴安的注意正相色谱时用的材料不一样。AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)PurgevalveMotorwithEncoderOutletBallValveActiveInletValve泵的根本原理串联泵往复活塞泵(单向阀)弹簧隔板/红宝石球串联柱塞泵消除流量脉冲

并联柱塞泵减小流量脉冲

低压四元泵Agilent1100四元泵工作原理DamperPurgevalveMixerABInletvalveOutletvalveWasteInletvalveOutletvalve复式二元泵工作原理〔串联单泵组合成高压二元〕Waters仪器：手动进样器-六通阀/定量环

手动进样器工作原理

装填状态样品注入手动进样器满环进样：应3倍以上体积，保证重现性。六通阀滑片〔显示沟槽〕机械手样品盘仪器：自动进样器自动进样器结构自动进样器工作原理泵柱子柱温箱外挂架色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径键合类型碳覆盖率封端化学性质固定相-填充材料物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度固定相-填充材料键合类型碳覆盖率封端化学性质固定相-填充材料固定相-填充材料仪器：检测器UV/Vis双灯，全波长检测ＤＡＤ检测器流路仪器：检测器-紫外反射镜1＃反射镜2＃氘灯光源透镜滤光片〔钬玻璃/遮光〕入射狭缝光栅分光器参比光电二极管数模转换板样品光电二极管数模转换板流通池紫外检测器工作原理Agilent1100可变波长紫外检测器(G1314A)DAD紫外检测器(G1315B)荧光检测器蒸发光检测器质谱检测器高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法一、保存时间变化1.柱温变化2.等度与梯度间未能充分平衡3.缓冲液容量不够4.柱污染5.流动相组成变化6.柱快到达寿命1.柱恒温2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.用>25mmol/L的缓冲液〔*中药少用〕4.每天冲洗柱5.防止流动相蒸发或盐沉淀在比例阀6、采用保护柱二、保存时间缩短1.流速增加2.样品超载3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度增高不稳1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流动相PH值保持在3～7.5

检查柱的方向4.防止流动相蒸发或盐沉淀在比例阀5.柱恒温三、保存时间延长1.流速下降2.硅胶柱上活性点变化3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度降低1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温四

、出现肩峰或分叉

1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成微小涡流通道4.柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏五、鬼峰

1.进样阀剩余峰2.样品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)5.水污染(反相)1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.处理样品3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.每天新配,用抗氧化剂5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

六、基线噪声

1.气泡(锋利峰)2.污染(随机噪声)3.检测器灯连续噪声4.电干扰(偶然噪声)5.检测器中有气泡1.流动相脱气,加柱后背压2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.更换氘灯4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.流动相脱气,加柱后背压七、峰拖尾

1.柱超载2.峰干扰3.硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道6.死体积或柱外体积过大7.柱效下降八、峰展宽

1.进样体积过大2.在进样阀中造成峰扩展3.数据系统采样速率太慢4.检测器时间常数过大1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.进样前后排出气泡以降低扩散3.设定速率应是每峰大于10点4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%八、峰展宽5.流动相粘度过高6.检测池体积过大7.保存时间过长8.柱外体积过大9.样品过载5.增加柱温,采用低粘度流动相6.用小体积池,卸下热交换器7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.将连接管径和连接管长度降至最小9.进小浓度小体积样品1.3流动相反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统〕，如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%,否那么C18链的随机卷曲将导致组分保存值变化，造成色谱系统不稳定。药典附录规定各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并到达系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分