基因编辑流程图

基因编辑流程图！CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(zinc-fingernuclease,ZFN)、转录激活样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)等技术后最为重要的基因改造技术，可以在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表观遗传修饰及3D基因结构改变中进行广泛的应用。我们可以发现第1-4步首先要设计需要编辑的基因位点，也就是我们说的靶基因。简单来说CRISPR基因编辑技术是一把科学精准的剪刀，但要用在哪里，还要我们精准解码基因信息，挖掘、定位控制优良性状的可以进行基因编辑的靶基因，这是基因编辑的第一步，也是最重要的基础。有道是“万事开头难”，当前，科研人员大量工作仍在基因挖掘阶段，这也是基因编辑工作最大的难点之一。LGCBiosearchTechnologies专有的KASP™基因分型技术通过SNP及Indel分子标记进行基因初定位及精细定位，助力关键主效功能靶基因定位及克隆，并帮助全基因组关联分析后的候选基因功能验证，使我们的育种家不断丰富可用于基因编辑的靶基因库，解决基因编辑的“开头难”问题。目前相关发表文献有千余篇，涉及到水稻、玉米、小麦等主粮作物，及番茄、黄瓜、大白菜等蔬菜作物，还有花生、油菜、大豆等经济作物的抗病虫害、产量及品质相关基因，应用前景广泛。第5步为基因编辑及载体构建，这个过程通常需要4天左右。其主要利用CRISPRRNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activatingcrRNA,tracrRNA）退⽕形成的复合物特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成DNA双链断裂，这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guidedRNA）进⾏简化。除了体外转录sgRNA外，现在我们也可以通过化学合成的方法合成sgRNA，并在合成过程中添加化学修饰，以减少核酸酶降解，提高整体编辑性能，提高其转化效率。该方法具有高效便捷、脱靶效应低、编辑效率高、无细胞毒性等优势，逐渐成为基因编辑基础科研实验的绝佳选择。LGCBiosearchTechnologies虽然没有相关的工具酶产品，但可以提供高性价比的各种型号的Mermade核酸合成仪（），可化学合成gRNA、sgRNA等CRISPR基因编辑技术中的关键组分，并可进行硫代和甲氧基等修饰，提高sgRNA的稳定性，降低脱靶效应。第6-126步（此过程也需要4天左右的时间），断开的DNA双链在同源重组（HR）作⽤下，供体质粒上的⽬标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组，完成DNA单碱基或片段编辑更改（此步为可选项，也可以不添加目标基因，只将目标片段敲除，创制突变体）。然后进行转化/转染并进行基因编辑个体基因型检测从而筛选基因编辑成功的个体。目前农业上主要采用农杆菌或基因枪侵染。这个过程中LGCBiosearchTechnologies可以提供专业高性价比的用于CRISPRsgRNA文库构建及质粒克隆的感受态细胞，被多篇文献报道过，其中也包括冷泉实验室的CRISPR慢病毒gRNAlibraries程序。在国内也有大量客户在使用。目前主要采用PCR技术来进行基因编辑个体及在第二代去掉外源载体或抗性基因（去标签）后的基因型检测。相对于测序来说，PCR成本更低，检测周期更短，KASP基因分型技术因其低成本高通量的特点也越来越多用于基因编辑流程中的基因型检测。具体引物设计方法为：在基因编辑序列或外源载体序列上设计一对引物，正向引物5’端加入FAM接头序列，然后在看家基因上设计另一对引物，其正向引物5’端加入HEX接头序列。这样我们通过KASP终点法PCR，就可以对基因编辑的个体进行定性分析，如果是非基因编辑的个体，则只有看家基因被扩