免疫学技术-酶免疫技术（临床免疫检验课件）

酶联免疫吸附试验案例酶联免疫吸附试验是于1971年分别由瑞典学者和荷兰学者报道的一种酶标固相免疫测定技术，这种技术出现后，不但成为了一种非常简单的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测并在临床应用中逐步取代了放免技术那么什么是酶联免疫吸附试验，基本原理是什么，有哪些方法类型基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量方法类型双抗体夹心法双位点一步法酶免疫技术检测抗原的方法检测抗体的方法竞争法间接法双抗原夹心法竞争法捕获法

E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法

EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体双位点一步法

酶标抗原

EEEE固相抗体标本（含抗原）底物E竞争法

固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体EE底物E竞争法

固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法固相抗人lgM抗体E标本（含抗体）抗原底物EE捕获法临床应用蛋白质测定病原微生物测定药物测定传染病的诊断各种免疫球蛋白补体肿瘤标志物结核杆菌幽门螺旋杆菌地高辛病毒性肝炎风疹病毒轮状病毒0102酶联免疫吸附试验的类型

小结酶联免疫吸附试验的原理CA思考题试述临床哪些指标采用酶联免疫法？酶联免疫法有哪些优势？酶免疫技术概述

案例酶免疫技术是三大经典标记技术之一1971年由Engvall和Perlmann及Vanweeman和Schuus两组学者分别用酶代替放射性核素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫技术，1975年问世的杂交瘤技术进一步促进了酶免疫技术的发展，当前酶免疫技术与形式各异、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展，已被广泛用于医学和生物学科的各个领域酶免疫分析技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原。将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相结合的一种免疫检测技术酶免疫技术酶免疫技术的特点01040203标记试剂能够长时间稳定灵敏度高、特异性强、准确性好操作简便、对环境没有污染易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法技术分类均相异相液相酶免疫测定固相酶免疫测定酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定标记酶的要求测定方法简便易行敏感、精确活性高纯度高作用专一性强性质稳定易与抗原或抗体偶联酶和底物对人体无害且价廉易得常用的酶和底物辣根过氧化物酶（HRP）常用的第一种酶是辣根过氧化物酶是由无色的糖蛋白和亚铁血红素结合而成的复合物辅基是酶的活性中心，主酶与活性无关纯度用RZ（纯度数）表示RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，与酶活性无关HRP是目前在酶联免疫吸附实验中应用最为广泛的标记酶常用的酶和底物反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色HRP的常见底物邻苯二胺四甲基联苯胺测定波长492nm缺点：不稳定，具有致癌性反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色测定波长450nm稳定，无致癌性缺点：水溶性差ELISA中应用最广泛的底物ALP底物经AlP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm

常用的酶和底物碱性磷酸酶是一种磷酸酯水解酶从大肠杆菌或小牛肠粘膜提取对-硝基苯磷酸酯（pNPP）制备酶标记抗体（抗原）的方法制备酶标记抗体(抗原）的方法制备酶标记物的方法应符合简单、产量高避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则戊二醛交联法改良过碘酸钠法塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状主要有微量反应板小试管和小珠三种微粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒膜载体是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜等固相载体0102常用的酶及底物

小结酶免疫技术基础知识思考题BA试述酶联免疫试剂盒包括哪些组成部分，简要说明其作用。膜载体酶免疫技术

案例固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相，标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色乳胶和胶体金等，常用的固相膜是硝酸纤维素膜。那么：什么膜载体酶免疫技术呢该技术的检测原理是什么？有哪些方法类型呢膜载体酶免疫技术膜载体酶免疫技术膜载体酶免疫技术是一种以膜为载体的酶免疫技术以膜为固相载体将蛋白质直接吸附或通过电转移方式转移至膜载体表面，形成固相抗原，加入特异性抗体和酶标记抗抗体温育后在膜表面形成免疫复合物，加底物显色在膜表面形成有色斑点或条带判定检测结果方法类型斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫渗滤试验免疫印迹试验030102斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫渗滤试验将NC膜封于塑料小盒中先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗体，干燥后封闭再依次加入待测标本、酶标抗体最后加入底物，阳性时可在膜上出现有色斑点免疫印迹试验关键技术膜载体结果观察包被与封闭抗原抗体反应用PBS浸湿5-10分钟，将适当浓度包被溶液加在相应位置，室温静置1-2小时。用牛血清白蛋白或脱脂奶室温下封闭过夜常用微孔滤膜是一种多孔性薄膜过滤材料包括固相膜和扩散膜包被好的NC膜加入待检标本、酶标记物等，让抗原抗体反应并达到平衡可肉眼观察显色区带直接获得定性结果，通过图像扫描可定量分析临床应用自身抗体谱的免疫印迹条过敏原特异性检测的试剂条0102临床应用01020304膜载体酶免疫技术的方法类型膜载体酶免疫技术的操作要点膜载体酶免疫技术的临床应用

小结膜载体酶免疫技术的检测原理BA思考题试述什么是westernblot?它的优点和临床应用有哪些？BAS-ELISA案例1936年，两位德国科学家从煮熟的鸭蛋黄中分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为“生物素”。生物素分子有两个环状结构，其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位，噻吩环C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。亲和素也称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用。生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin-System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。近年来大量研究证实，生物素-亲和素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术

生物素-亲和素系统生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin-System，BAS)是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术概述

生物素-亲和素系统基本类型及原理反应层次直接法间接法BA-ELISAAg-（Ab-B）-A＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-A＊BAB-ELISAAg-（Ab-B）-A-B＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-A-B＊ABC-ELISAAg-（Ab-B）-AB＊CAg-Ab1-（Ab2-B）-AB＊CA＊为标记亲和素B＊为标记生物素

BA-ELISA检测抗原

BA-ELISA检测抗体

BAB-ELISA

ABC