高效液相色谱法课件

第20章高效液相色谱法20.1概述20.2高效液相色谱仪20.3液相色谱分离分析法20.4高效液相色谱固定相和流动相20.1概述一、高效液相色谱的特点二、高效液相色谱的分类分析对象气相色谱：气体和沸点较低的化合物，占有机物总数20%高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，占有机物总数80%流动相气相色谱：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响高效液相色谱：可选用不同极性的液体；选择余地大；对分离影响大（与组分或固定相均作用）色谱柱温气相色谱：一般较高高效液相色谱：通常为室温高效液相色谱vs气相色谱一、高效液相色谱的特点高压：150-350105Pa高速：一般<1h,<1min.高效：柱效高高灵敏度：10-9g（紫外检测器）

10-12g（荧光检测器）成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂；缺少灵敏度高的通用型检测器；复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱；受压易分解或变性的生物样品。优点：局限：高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析二、高效液相色谱的分类分配色谱吸附色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱疏水作用色谱按分离原理制备色谱柱内径>10mm半制备色谱柱内径>5-10mm分析型色谱柱内径<5mm按分离规模20.2高效液相色谱仪1.流程一、流程及主要部件高压输液系统进样系统分离系统检测系统附属系统2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa；为获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一；具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。柱塞式往复泵(2)梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(3)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(4)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。匀浆法装柱示意图高效液相色谱填料填料的热力学特性影响色谱柱的选择性填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率（颗粒的大小、形状、均匀性、比表面积；孔径、孔体积等）。基质无机基质材料硅胶(silica)、氧化铝、氧化锆、氧化钛、羟基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等有机基质材料：天然多糖凝胶（如葡聚糖系、琼脂糖系等）高聚物树脂（如交联苯乙烯树脂、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂等）特点颗粒状整体柱微孔---孔径<2nm；中孔---孔径<50nm,>2nm；大孔---孔径>50nm使用中孔和大孔填料；微孔易造成色谱峰拖尾物理形态(5)液相色谱检测器溶质性质检测器：对被分离组分的物理或化学特性有响应紫外、荧光、电化学检测器等总体检测器：对试样和流动相总的物理或化学性质有响应示差折光检测器、电导检测器等分类紫外光度检测器(ultravioletphotometricdetector)光电二极管阵列检测器(photo-diodearraydetector)荧光检测器(fluorescencedetector)示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector)蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector)电导检测器(electricalconductivitydetector)常用检测器a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高、线性范围宽；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

它与固定波长紫外检测器的主要差别在于使用一个连续光源（如氘灯），以光栅（或棱镜）分光。光源发出的复合光（从190nm至600nm附近），光栅分光能够随意选择定的检测波长以匹配被测物质的最大吸收波长。b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。二极管阵列检测器可以记录190nm-900nm波长吸收光谱数据，可直接贮存色谱图中每一个点的吸收光谱。光源发出的光，通过透镜把光聚焦在检测池上。从检测池出来的光，通过透镜、狭缝到全息光栅上，经光栅分光后由一排光电二极管接收并转换为电信号，贮存于计算机中。DAD的最大优点在于利用ＵＶ光谱识别并进行纯度分析，还可以画出保留时间、波长和吸光度的三维立体空间谱图等，这是目前较先进的紫外检测器。光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；d.荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；20.3高效液相色谱的主要类型一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchange

chromatograph四、离子对色谱ion-pairchromatograph五、排阻色谱size-exclusionchromatograph六、亲和色谱(AC)Affinity

chromatograph高效液相色谱的主要类型一、液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；硅胶的表面结构与性质极性相互作用应用实例硝基苯酚异构体的偶极矩：对位５．６７Ｄ间位５．１０Ｄ邻位３．７１Ｄ硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的组成可改变分离的选择性二、液-液分配色谱

liquid-liquidpartitionchromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相的色谱法ODS示意图疏溶剂作用理论组分流出顺序为：疏水性小者先流出疏水性大者后流出正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系应用实例（芳香烃）三、离子交换色谱

ion-exchangechromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。离子交换分离原理溶液pH值调控固定相电荷，溶液离子强度调控静电作用应用实例：稀土离子分离四、离子对色谱ionpairchromatography定义：把离子对试剂加入到极性流动相中，被测组分与其中离子对试剂的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。适用：可离子化或离子型化合物，如有机酸、碱、盐的分离。机理：试样在流动相中与离子对试剂离解出的反离子生成不荷电的疏水离子对，然后溶解或吸附在疏水固定相上，使得中性离子对在固定相和流动相中达成分配平衡。反相离子对色谱：固定相一般为烷基键合硅胶固定相，如ODS1.去甲肾上腺素2.肾上腺素3.多巴胺IS:3,4-二羟基苯甲胺固定相：C8流动相：含辛基硫酸钠的缓冲溶液+甲醇尿中儿茶酚胺类化合物的分析五、排阻色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离分离原理应用实例（苯乙烯寡聚体）六、亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大