红细胞疾病及其检验-溶血性贫血的相关检验（血液学检验课件）

第一节概述溶血性贫血是指由于某种原因使红细胞寿命缩短、破坏增加，超过骨髓造血代偿能力所致的一类贫血。

代偿性溶血性疾病是指若红细胞寿命缩短、破坏增加，但尚未超过骨髓造血的代偿能力时，临床上不表现贫血。一、溶血性贫血分类溶血性贫血按溶血的场所分类血管内溶血：RBC多在血液循环中被破坏血管外溶血：RBC多在单核巨噬细胞中被破坏按溶血的急缓分类急性溶血性贫血慢性溶血性贫血按病因和发病机制分类遗传性溶血性贫血：多为RBC内在缺陷获得性溶血性贫血：多为RBC外在缺陷一、溶血性贫血分类病

因主

要

疾

病主要溶血部位遗传性溶血性贫血

红细胞膜缺陷遗传性球形红细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症遗传性口形红细胞增多症棘细胞增多症血管外血管外血管外血管外磷酸戊糖途径和谷胱甘肽代谢酶类缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症谷氨酰半胱氨酸合成酶缺陷症血管外血管外红细胞酵解酶类缺乏丙酮酸激酶缺陷症葡萄糖磷酸异构酶缺陷症血管外血管外血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血镰状细胞贫血不稳定血红蛋白病血管外血管外血管外溶血性贫血的病因学分类一、溶血性贫血分类溶血性贫血的病因学分类病

因主

要

疾

病主要溶血部位获得性溶血性贫血

免疫因素自身免疫性溶血性贫血冷凝集素综合征阵发性冷性血红蛋白尿症药物诱发的免疫性溶血性贫血新生儿同种免疫性溶血性贫血溶血性输血反应血管外/内血管外血管内血管外/内血管外血管外/内红细胞膜缺陷阵发性睡眠性血红蛋白尿症血管内物理损伤微血管病性溶血性贫血心源性溶血性贫血行军性血红蛋白尿症血管内血管内血管内化学因素砷化物、硝基苯、苯肼、蛇毒等中毒血管内/外感染因素溶血性链球菌、疟原虫、产气荚膜杆菌等感染血管内其他脾功能亢进血管外二、溶血性贫血的发病机制

红细胞过早地被破坏可以发生在血管外或血管内。（一）血管外溶血：即红细胞被脾、肝的单核-巨噬细胞系统吞噬后破坏。（二）血管内溶血：红细胞直接在血循环中破裂，红细胞的内容物血红蛋白直接被释放入血浆。红细胞在单核-巨噬细胞中破环在血管内破环血管外溶血血管内溶血二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血结合珠蛋白是肝脏合成的一种α2糖蛋白，约占血浆总蛋白的1%，溶血较多时血浆中结合珠蛋白浓度显著降低或消失，但肝病也可引起降低，而感染和恶性肿瘤时Hp却增高，故正常或增高不一定能排除溶血。血管内溶血血红蛋白释放入血与结合珠蛋白（Hp）结合Hp-Hb复合物分子较大，不被肾脏排泄而被肝细胞摄取并清除，最后转变成胆红素二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血血红素结合蛋白是肝脏合成的一种β1球蛋白，大量溶血时血浆血红素结合蛋白的浓度亦降低。当血浆内结合珠蛋白全部与血红蛋白结合后剩余的游离血红蛋白可转变为高铁血红蛋白（MHb）MHb分解为高铁血红素和珠蛋白MHb与血浆白蛋白或血红素结合蛋白（Hx）结合形成高铁血红素白蛋白（MHAlb）或Hx-血红素被肝细胞摄取并清除二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血血液中的高铁血红素白蛋白（MHAlb）转换缓慢，它的出现表明有较严重的血管内溶血。血浆中含有较多游离的血红蛋白而呈粉红色，但由于高铁血红素白蛋白呈棕色，高铁血红蛋白呈褐色，因此游离的血红蛋白呈现的粉红色被掩盖而不易察觉。二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血当血浆中的蛋白质与血红蛋白的结合达到饱和时，未结合的血红蛋白由于分子较小（分子量66000）出现于尿内，使尿色变红。高铁血红蛋白亦可出现于尿内，使尿呈褐色，高铁血红素白蛋白由于分子大、不出现于尿内。二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血尿中血红蛋白被肾小管上皮细胞吸收后分解的铁，以铁蛋白及含铁血黄素的形式贮积于肾小管上皮细胞内，随上皮细胞脱落随尿排出，与亚铁氰化钾反应产生普鲁氏蓝反应定位于肾小管上皮细胞内，呈蓝色的含铁血黄素颗粒，含铁血黄素尿常出现于慢性血管内溶血，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症及机械性溶血性贫血。二、溶血性贫血的发病机制（二）血管内溶血溶血时血红蛋白代谢示意图三、溶血性贫血的诊断诊断手段确定溶血的存在红细胞寿命测定51Cr标记RBC，注入体内，观察标记RBC的放射性消失率。或利用放射性核素参加RBC生成，测定放射性在RBC中的消失时间RBC破坏过多红细胞破坏过多血红蛋白，RBC碎片,游离Hb浓度、血清结合珠蛋白、间接胆红素，尿胆原、尿含铁血黄素和血清乳酸脱氢酶骨髓红细胞系统代偿性增生网织红细胞明显增多，骨髓红系增生明显活跃，粒红比例降低或倒置确定主要的溶血部位血管内溶血多为急性发作，以获得性溶血性贫血多见血管外溶血为红细胞被单核-吞噬细胞系统清除增加，多为慢性经过，常伴脾肿大确定溶血原因病史和临床检查资料对分析溶血的病因异常的球性红细胞、椭圆形红细胞、口形红细胞、靶形红细胞和镰形红细胞三、溶血性贫血的诊断特征血管内溶血血管外溶血病因获得性多见遗传性多见红细胞主要破坏场所血管内单核-吞噬细胞系统病程多为急性常为慢性，急性加重贫血、黄疸常见常见肝、脾大少见常见红细胞形态异常正常或轻微异常明显异常红细胞脆性改变变化小多有改变血浆游离血红蛋白增加正常或轻度增高高铁血红素白蛋白增加正常血红蛋白尿常见无或轻度尿含铁血黄素慢性可见一般阴性骨髓再障危象少见急性溶血加重时可见LDH增高轻度增高血管内溶血和血管外溶血的鉴别三、溶血性贫血的诊断部位溶血性贫血疾病名称筛选/排除试验确诊试验血管外溶血

遗传性球形红细胞增多症红细胞形态检查高渗冷溶血试验遗传性椭圆形红细胞增多症渗透脆性试验、酸化甘油溶血试验膜蛋白电泳分析、膜脂质分析遗传性口形红细胞增多症自身溶血试验、红细胞腺苷三磷酸活性、Coombs试验膜蛋白基因分析、家系调查G-6-PD-CNSHA高铁血红蛋白还原试验、G-6-PD荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝试验、Heinz小体生成试验红细胞G-6-PD活性测定基因分析丙酮酸激酶缺乏症

红细胞形态检查、PK荧光斑点试验PK活性定量测定嘧啶-核苷酶缺乏症红细胞形态检查、Ret、嘧啶核苷酸比率中间代谢产物测定、嘧啶-核苷酶活性测定珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白病红细胞形态检查、红细胞包涵体试验、异丙醇沉淀试验、热变性试验、Heinz小体生成试验红细胞镰变试验、血红蛋白电泳、珠蛋白肽链分析、基因分析、吸收光谱测定温抗体型自身免疫性溶贫红细胞形态检查Coombs试验冷凝集素综合征红细胞形态检查、Coombs试验冷凝集素试验药物致免疫性溶血贫血红细胞形态检查、Coombs试验加药后IAGT新生儿同种免疫性溶血症红细胞形态检查、Ret、胆红素代谢检查、血型鉴定Coombs试验、孕妇产前免疫性抗体检查迟发性溶血性输血反应红细胞形态检查、Ret、血型鉴定

Coombs试验、聚凝胺试验不同类型溶血性贫血试验选择三、溶血性贫血的诊断不同类型溶血性贫血试验选择部位溶血性贫血疾病名称筛选/排除试验确诊试验血管内溶血PNHRous试验、尿隐血试验、蔗糖溶血试验Ham试验、蛇毒溶血因子试验、补体敏感性试验蚕豆病高铁血红蛋白还原试验、G-6-PD荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝试验、Heinz小体生成试验红细胞G-6-PD活性测定、基因分析阵发性冷性血红蛋白尿症Rous试验、Coombs试验冷热溶血试验药物致免疫性溶血性贫血Coombs试验IAGT及加药后的IAGT急发性溶血性输血反应Coombs试验血型鉴定及不同方法的交叉配血试验微血管病性溶血性贫血红细胞形态检查、Ret、血小板计数、血浆游离血红蛋白测定等止血与血栓实验室检查及其他相关检查三、溶血性贫血的诊断遗传性溶血性贫血表现膜结构异常、酶异常和血红蛋白异常，红细胞渗透脆性试验可作为遗传性溶血性贫血病因诊断的过筛试验：（1）红细胞渗透脆性增高，提示红细胞膜异常，注意结合红细胞的形态学变化。（2）红细胞渗透脆性正常，提示红细胞酶异常，应进一步测定红细胞酶类的活性。（3）红细胞渗透脆性降低，提示血红蛋白异常，应进一步做血红蛋白电泳。三、溶血性贫血的诊断红细胞渗透脆性试验增高：膜异常正常：酶异常降低：血红蛋白异常遗传性球性红细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症遗传性口形红细胞增多症G-6PD缺乏PK缺乏G-6-PD酶活性降低PK酶活性降低球性红细胞>10%、自身溶血试验阳性椭圆形红细胞>15%口形红细胞增多α-地中海贫血HbBarts增高或HbH增高β-地中海贫血HbA2增高、HbF增高镰形细胞贫血红细胞镰变试验阳性、HbS增加不稳定血红蛋白病异丙醇试验阳性，变性珠蛋白小体>30%遗传性溶血性贫血的过筛试验四、溶血性贫血的过筛试验常用的溶血性贫血的过筛试验游离血红蛋白血清结合珠蛋白尿含铁血黄素高铁血红素蛋白RBC在

血管内破坏的证据四、溶血性贫血的过筛试验（一）血浆游离血红蛋白测定【实验原理】常用邻-甲苯胺法检测，血红蛋白结构中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，催化过氧化氢释放新生态氧，使无色的邻-联甲苯胺氧化为蓝色。根据显色深浅，即可测出血浆游离血红蛋白的量。四、溶血性贫血的过筛试验（一）血浆游离血红蛋白测定【实验原理】【参考区间】0～40mg/L血红蛋白结构中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用H2O2新生态O无色的邻-联甲苯胺氧化为蓝色四、溶血性贫血的过筛试验（一）血浆游离血红蛋白测定【临床意义】正常情况，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。1.游离血红蛋白明显增高是判断血管内溶血的指征。蚕豆病、PNH、阵发性寒冷性血红蛋白尿、冷凝集素综合征、溶血性输血反应等明显增高；自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻到中度增高。四、溶血性贫血的过筛试验（一）血浆游离血红蛋白测定【临床意义】正常情况，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。2.血管外溶血、红细胞膜缺陷不增高。四、溶血性贫血的过筛试验（二）血清结合珠蛋白测定

结合珠蛋白（Hp）是由肝脏合成的一种α2糖蛋白，合成速度较慢；Hp具有结合游离血红蛋白的能力，在血红蛋白降解为胆红素的代谢过程中具有重要的作用，在此过程中Hp本身也被分解，溶血性贫血时Hp因消耗而下降。四、溶血性贫血的过筛试验（二）血清结合珠蛋白测定【实验原理】用醋酸纤维薄膜电泳法检测，由于Hp具有结合游离血红蛋白的能力，故在测定血清Hp时，于待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与待测血清中的Hp形成Hp-Hb复合物；再通过电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开，测定Hp-Hb复合物的量，可测得血清中Hp的含量。【参考区间】0.5～1.5gHb/L四、溶血性贫血的过筛试验（二）血清结合珠蛋白测定【临床意义】正常情况下，血浆中的血红蛋白与结合珠蛋白结合形成复合物，在单核-吞噬细胞系统和肝内被消除。溶血时血浆中的血红蛋白与Hp结合增多，使血清中结合珠蛋白减少，测定血清中结合珠蛋白的含量可反映溶血的情况。四、溶血性贫血的过筛试验（二）血清结合珠蛋白测定【临床意义】1.减低常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。但严重肝病、先天性无珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等Hp也明显减低，故注意鉴别。2.增高常见于感染、创伤、SLE、恶性肿瘤、类固醇治疗、妊娠、胆道堵塞等（Hp为急性时相反应蛋白）。此时如Hp正常，不能排除合并溶血的可能。四、溶血性贫血的过筛试验（三）尿含铁血黄素试验【实验原理】当游离血红蛋白在血液中增多时，血红蛋白通过肾脏滤过产生血红蛋白尿；在此过程中，血红蛋白被肾小管上皮细胞部分或全部吸收，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。四、溶血性贫血的过筛试验（三）尿含铁血黄素试验【实验原理】含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，为含铁质的棕色色素，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀，此反应称为普鲁士蓝反应。用显微镜检查尿沉渣，细胞内外可见直径1～3μｍ的蓝色颗粒。【参考区间】

正常人为阴性。四、溶血性贫血的过筛试验（三）尿含铁血黄素试验【临床意义】

尿含铁血黄素试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNH，本试验即呈阳性，并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验可呈阴性反应。四、溶血性贫血的过筛试验（四）高铁血红素白蛋白试验【实验原理】血红蛋白与Hp结合成Hb-Hp肝脏降解清除过剩的Hb珠蛋白血红素与白蛋白结合与血红素结合蛋白结合高铁血红素与血红蛋白结合Hp消耗完后与白蛋白结合高铁血红素白蛋白与硫化铵形成铵血色原比色测定血红蛋白尿四、溶血性贫血的过筛试验（四）高铁血红素白蛋白试验【参考区间】

正常人呈阴性。【临床意义】

血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。只有在严重溶血时，Hp与Hx均被耗尽，高铁血红素方与白蛋白结合成高铁血红素白蛋白；故血清中出现高铁血红素白蛋白是溶血严重的指标。第二节红细胞膜缺陷检查及应用红细胞携带氧气和二氧化碳，为体内重要的气体交换单元。膜功能：变形性，调节细胞内离子平衡，维持细胞容积，稳定内环境红细胞膜参与细胞运输、信息传递、血型抗原、免疫反应、免疫调节及出、凝血调节等反应。红细胞直径为6～9μm，呈双层凹面的圆盘状一、概述低渗溶液中，血红蛋白逸出，红细胞残留的完整的红细胞膜，称为影细胞红细胞膜：蛋白质占49.3％脂质42％糖类8％蛋白质与脂质的比例约为1:1；比值变化与膜的功能相关，决定着膜的理化特征任何原因引起的溶血都必然有红细胞膜的缺陷或损伤低渗一、概述红细胞膜膜蛋白膜脂质膜糖类与膜脂质形成糖脂与膜蛋白形成糖蛋白糖链裸露膜外，有受体、抗原性、信息传递功能，称之细胞天线磷脂糖脂胆固醇甘油磷脂鞘磷脂胆固醇脂游离胆固醇鞘糖脂与膜脂质形成脂蛋白与糖类形成糖蛋白外周蛋白内在蛋白胆固醇/磷脂（C/P）比值约为0.8～1.0一、概述

膜蛋白采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS）可将红细胞膜的蛋白质分成7～8条主带，命名为1、2、3、4、5、6、7和8。一、概述膜蛋白当红细胞膜用Triton-100处理约1小时，去除大部分膜磷脂及胆固醇，剩余的膜在相差显微镜下观察仍为双凹圆盘形，这时的膜组成有区带1、2、2.1、4.1、4.9及5，这些蛋白被称为“膜骨架蛋白”或Triton壳（Tritonshell），它们在维持红细胞形态及功能上起着重要作用。一、概述

红细胞膜结构

液态镶嵌模型：红细胞膜为脂质双层结构，蛋白质镶嵌在脂质双层内又相互连续形成膜的骨架。电镜下观察红细胞膜呈三层暗-亮-暗区带，外层含糖脂、糖蛋白和蛋白质，具亲水性；中间层含磷脂、胆固醇、蛋白质为疏水性；内层主要包含蛋白质，呈亲水性。一、概述

红细胞膜结构带3带4.2锚蛋白α膜收缩蛋白β膜收缩蛋白肌动蛋白带4.1血型蛋白C膜脂质双层一、概述

红细胞膜结构红细胞膜结构的两个基本的特征膜的不对称性膜的流动性膜的内外两层的组分和功能有明显的差异，称为膜的不对称性膜脂的不对称性膜蛋白的不对称性复合糖的不对称性一、概述

红细胞膜的功能运输物质变形性免疫功能抗原性血型抗原老化抗原影响变形性因素：①膜骨架蛋白组分和功能状态②膜脂质流动性大有利于变形③细胞表面积与体积比值④血红蛋白的质和量⑤膜的离子通透性一、概述

红细胞膜的功能衰老或病变RBC的清除主要是在通过脾脏时被吞噬细胞吞噬，研究认为异常RBC膜表面出现了新的抗原，称之为老化抗原（SCA），被血浆自身抗体识别并结合，吞噬细胞有IgGFc段受体，识别结合在异常RBC上的IgG，将其吞噬二、实验室检查红细胞渗透脆性试验红细胞膜蛋白电泳分析血细胞表型分析红细胞孵育渗透脆性试验酸化血清溶血试验蔗糖溶血试验红细胞自身溶血试验及其纠正试验常见实验室检查酸化甘油溶血试验二、实验室检查（一）红细胞渗透脆性试验【实验原理】红细胞在不同浓度的低渗溶液中，水分通过红细胞膜进入细胞内，当水渗透达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞对低渗盐溶液的抵抗能力。二、实验室检查（一）红细胞渗透脆性试验【实验原理】红细胞对低渗的抵抗能力与其表面积与容积的比值有关，比值小，说明红细胞容积已胀大，对低渗抵抗力小，渗透脆性增加；反之抵抗力增大，渗透脆性降低。低渗盐低渗盐二、实验室检查（一）红细胞渗透脆性试验【参考区间】简易半定量法：开始溶血：3.8～4.6g/L；完全溶血：2.8～3.2g/L。二、实验室检查（一）红细胞渗透脆性试验【临床意义】增加主要见遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血。降低主要见于珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C、D、E病，低色素性贫血、阻塞性黄胆、脾切除术后等。二、实验室检查（二）红细胞孵育渗透脆性试验【实验原理】血液置于37℃温箱孵育24h葡萄糖的消耗，贮备的ATP减少膜对阳离子的主动传递受阻，Na在红细胞内聚集红细胞膨胀，孵育渗透脆性增加正常人的红细胞经孵育处理后，其渗透脆性变化不明显，而有细胞膜缺陷或某些酶缺陷的红细胞，由于其内的葡萄糖和ATP很快被消耗，孵育后脆性明显增加。二、实验室检查（二）红细胞孵育渗透脆性试验【参考区间】未孵育50%溶血：4.00～4.45gNaCl/L；37℃孵育24h50%溶血：4.65～5.90gNaCl/L二、实验室检查（二）红细胞孵育渗透脆性试验【临床意义】本试验用于轻型遗传性红细胞增多症，遗传性非球形红细胞溶血性贫血的诊断和鉴别诊断。

脆性增加见于轻型遗传性红细胞增多症，遗传性非球形红细胞溶血性贫血。

脆性减低见于珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、脾切除手术后。二、实验室检查（三）红细胞自身溶血试验及其纠正试验【实验原理】血液置于37℃温箱孵育24h葡萄糖的消耗，贮备的ATP减少膜对阳离子的主动传递受阻，Na在红细胞内聚集红细胞膨胀，孵育渗透脆性增加在孵育时，加入葡萄糖和ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。二、实验室检查（三）红细胞自身溶血试验及其纠正试验【参考区间】正常人红细胞孵育48小时，不加纠正物的溶血率<4.0%，加葡萄糖的溶血率<1.0%，加ATP纠正物的溶血率<0.8%。二、实验室检查（三）红细胞自身溶血试验及其纠正试验【临床意义】遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，能被葡萄糖或ATP纠正。G-6-PD缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正。丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生ATP，溶血率增加，不能被葡萄糖纠正，能被ATP可纠正。

二、实验室检查（三）红细胞自身溶血试验及其纠正试验【临床意义】获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同，对诊断意义不大。本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值，其他多仅作为筛选试验。二、实验室检查（三）红细胞自身溶血试验及其纠正试验【临床意义】Daice认为第Ⅰ型自身溶血仅轻度增高，加葡萄糖后纠正；第Ⅱ型自身溶血显著增高，加葡萄糖不能纠正，但加ATP后可以纠正，说明其ATP生成障碍，而其实质是PK缺乏。

二、实验室检查（四）酸化甘油溶血试验【实验原理】

遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值降低、细胞球形化，膜蛋白及膜脂质有缺陷当甘油存在于低渗溶液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质逐步溶解而减少。它们在pH6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。二、实验室检查（四）酸化甘油溶血试验【参考区间】

正常人AGLT50>290s。【临床意义】

遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短（15～25s）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。

二、实验室检查（五）酸化血清溶血试验【实验原理】

正常人的血清，在pH6.4～6.6条件下酸化，补体被激活PNH患者体内存在对补体敏感的红细胞，在此条件下发生溶血。而正常人的红细胞不被溶解。将血清加热56℃30min灭活补体后，血清失去溶血作用。二、实验室检查（五）酸化血清溶血试验【参考区间】正常人为阴性【临床意义】本实验是PNH的确证实验；其假阳性和假阴性较少见，但如患者多次输血而使其补体敏感红细胞相对减少时，可呈弱阳性或阴性。某些自身免疫性溶血性贫血患者溶血发作严重时也偶呈阳性，此时，如果血清加热破坏补体后，试验结果由阳性转变为阴性，那么更支持PNH的诊断。

二、实验室检查（六）蔗糖溶血试验【实验原理】【参考区间】正常人为阴性

PNH患者因红细胞膜有缺陷而对补体敏感在离低子强度的蔗糖溶液中，补体与细胞膜的结合加强使对补体敏感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损二、实验室检查（六）蔗糖溶血试验【临床意义】本试验比酸溶血试验敏感，但特异性较差，是PNH简易过筛试验。再生障碍性贫血、巨幼红细胞性贫血和自身免疫性溶血性贫血患者也可出现阳性，故必要时需做酸化血清溶血试验加以鉴别。

二、实验室检查（七）血细胞表型分析【实验原理】PNH是一种获得性基因突变导致的克隆性疾病，其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂－锚（GPI-anchor）连接蛋白如CD59,CD55等表达明显减低或缺乏，细胞膜对补体的敏感性增强而引起溶血性贫血。用GPI连接蛋白如CD59的单克隆抗体作分子探针，流式细胞术分析红细胞和白细胞膜CD59等分子的表达量和计数其缺乏表达（阴性）细胞的数量。

二、实验室检查（七）血细胞表型分析【参考范围】PNH诊断的临界值：CD59阴性的红细胞大于5%和CD59阴性的中性粒细胞大于10%，非PNH者均小于5%；PNH患者CD59阴性的红细胞大于9%，多数患者大于20%；CD59阴性的中性粒细胞均大于16%。

二、实验室检查（七）血细胞表型分析【临床意义】

该实验的灵敏度和特异性可达100％，而Ham实验的灵敏度为50％左右，但实验需要的流式细胞仪其价格比较贵，实验价格也较高。

二、实验室检查（八）红细胞膜蛋白电泳分析【实验原理】将制备的红细胞膜样品进行SDS电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。

二、实验室检查（八）红细胞膜蛋白电泳分析【参考区间】红细胞各种膜蛋白组分百分率变化较大，与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。或以带3蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带3蛋白的比例表示。

二、实验室检查（八）红细胞膜蛋白电泳分析【临床意义】许多先天性和后天性溶血性贫血都伴有红细胞膜蛋白异常，各种膜缺陷疾病如遗传球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。

三、红细胞膜缺陷检查的应用

红细胞膜缺陷原发性先天性遗传性球形细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症遗传性口形红细胞增多症后天获得性继发性红细胞酶或血红蛋白缺陷外在因素影响三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【概述】

遗传性球形红细胞增多症是一种红细胞膜蛋白结构异常所致的遗传性溶血病，其特点是外周血中出现较多小球形红细胞。多呈常染色体显性遗传，少数呈常染色体隐性遗传的HS常合并新的基因突变而发病，研究显示HS有第8号染色体短臂缺失。贫血、黄疸和脾肿大，是最常见的临床表现三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【概述】

RBC膜收缩蛋白自身聚合位点及其结构的区域异常膜结构与功能的异常钠泵功能亢进，钠、水进入细胞增多红细胞呈球形红细胞内的ATP相对缺乏钙-ATP酶受抑制，钙沉积膜上，膜的柔韧性降低该RBC通过脾脏被截留，于巨噬细胞内破坏破坏不能被机体代偿时出现溶血性贫血三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【实验室检查】1.血象

Hb和RBC量多为正常或轻度降低，血片中出现小球形红细胞为特征；Ret细胞增加，一般为5%～10%，急性溶血发作时可高60%～70%。嗜多色性RBC增多，外周血中可有少数幼稚RBC。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【实验室检查】1.血象

球形红细胞较正常红细胞小、厚，且深染，大小比较均一，直径变小（6.2～7.0µm），厚度增加（2.2～3.4µm），染色后细胞中央淡染区消失，小球形红细胞所占的比例在不同的患者中差别较大，多数患者在10%以上（正常人多<5%）。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【实验室检查】2.骨髓象RBC增生旺盛，粒红比值降低，红系以中、晚幼红为主，可占有核细胞的25%～60%；当发生再障危象时，骨髓中红系再生低下，有核RBC减少。3.渗透脆性试验HS红细胞渗透脆性增高

三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【实验室检查】4.红细胞膜电泳分析SDS电泳可得到红细胞膜蛋白各组分的百分率，80%的患者可发现异常。5.红细胞膜蛋白定量测定绝大多数HS有一种或多种膜蛋白缺乏。6.分子生物学技术应用

三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【诊断和鉴别诊断】HS无特异的临床表现和实验室检查，诊断时应结合病史、临床表现和实验室检查综合分析。血涂片中小球形细胞大于10%，红细胞渗脆性增加，有阳性的家族史，本病的诊断可成立。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（HS）【诊断和鉴别诊断】注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形细胞增多相鉴别，后者Coombs（+）。对Coombs试验多次阴性者，应作红细胞膜蛋白分析和组分定量，必要时采用基因序列分析的方法，寻找诊断依据和进行家系调查以鉴别诊断。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（二）遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)【概述】遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)是一组由于红细胞膜蛋白异常引起的异质性家族遗传性溶血病，其共同特点是外周血中存在大量的椭圆形成熟红细胞。HE大多为常染色体显性遗传，极少数为常染色体隐性遗传。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（二）遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)【概述】本病的原发病变是膜骨架蛋白异常，其膜收缩蛋白结构有缺陷，膜骨架稳定性降低。HE的红细胞在骨髓释放入血液循环后由于膜骨架蛋白的缺陷，在通过微循环时由于切变力的作用变成椭圆形后不能恢复正常，同时，红细胞由于膜骨架稳定性的降低容易破坏，大多数椭圆形红细胞在脾脏被破坏。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（二）遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)【实验室检查】1.血象

多有贫血，隐匿型可表现正常。血片中椭圆形红细胞的比例大于25%。其形状呈椭圆形、卵圆形、棒状或腊肠形，椭圆形红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增加，中心淡染区消失。2.骨髓象

骨髓红系增生活跃为增生性贫血骨髓象。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（二）遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)【实验室检查】3.红细胞渗透脆性试验红细胞渗透脆性试验和自身溶血试验多增高。4.红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜收缩蛋白分析其异常结果有助于膜分子病变的确定。5.分子生物学方法检测某些膜蛋白基因突变。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（二）遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)【诊断和鉴别诊断】依据临床表现、家族调查和相关实验室检查多数病例可确诊，无阳性家族史时若椭圆形红细胞大于50%也可明确诊断。本病应与缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、骨髓纤维化、骨髓病性贫血、骨髓增生异常综合征、珠蛋白生成障碍性贫血等鉴别。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【概述】遗传性口形红细胞增多症是一种罕见的常染色体显性遗传性慢性溶血性贫血。本病的特征是血片中出现较多的口形红细胞，有轻重不一的溶血阳性家族史。HST不是单一的疾病，而是发病机制、红细胞形态和临床表现都不同的一组综合症。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【概述】在口形细胞中，钠离子浓度增高，钾离子浓度减低，从而使离子泵的负荷增至6～10倍，但仍不足以代偿钠钾的失衡状态，导致细胞水肿、肿胀，体积增大，红细胞脆性增高。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【概述】根据口形红细胞内钠、钾离子和阳离子总量的多少，将此症分为三型：

水肿细胞型又称水肿细胞增多症，其细胞内钠、钾离子和阳离子总量明显增多，致水分进入细胞内，使红细胞肿胀表现为口形；此型细胞渗透脆性增加，变形能力减弱，在脾扣留被巨噬细胞吞噬破坏。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【概述】干细胞型又称干细胞增多症或脱水型细胞增多症，由于细胞脱水致红细胞边缘皱褶或不规则，有时可呈靶形；此种细胞变形能力降低，红细胞渗透脆性降低，主要在单核-巨噬细胞系统内破坏。

其他细胞型。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【实验室检查】血片中口形红细胞增多，可达10%～50%。口形红细胞中心苍白区呈狭窄的裂缝，裂缝的中央较两端更为狭窄，缝的边缘清楚，类似微张的鱼口；而在湿血片中，红细胞双凹面消失而呈单面凹，形似碗状。正常人外周血中也可见到少量口形细胞，一般为小于4%。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【实验室检查】贫血一般轻微，血红蛋白很少低于80g/L，多数患者网织红细胞增多，约10％～20％；红细胞渗透脆性试验增高，也可正常或降低；自身溶血可呈阳性，可被葡萄糖或ATP部分纠正。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（三）遗传性口形红细胞增多症(HST)【诊断和鉴别诊断】

依据临床表现、外周血口形红细胞增多和家族史一般可作出诊断。但需要与继发性口形红细胞增多鉴别，继发性口形红细胞增多除口形红细胞增多外，一般无溶血，缺乏家族史，并具有相应疾病的特征。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【概述】1.定义

是一种获得性造血干细胞基因突变引起红细胞膜缺陷所致的溶血病。出现细胞膜对自身补体（C3）敏感性增高的异常红细胞，引起慢性血管内溶血。睡眠时加重，可伴发作性血红蛋白尿和全血细胞减少症。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【概述】2.发病机制

骨髓造血组织受到损伤，而引起多能造血干细胞的基因突变，产生膜异常的干细胞克隆，异常造血干细胞不断增生、分化，形成具有PNH缺陷的细胞群；这种缺陷不仅累及红细胞，也累及患者的粒细胞、淋巴细胞和血小板。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【概述】3.患者体内红细胞分三型Ⅰ型对补体的敏感性正常；Ⅱ型对补体中度敏感；Ⅲ型对补体高度敏感。4.临床表现与睡眠有关的间歇溶血发作，以血红蛋白尿为主要特征，多为慢性血管内溶血，伴有全血细胞减少和反复血栓形成。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【实验室检查】1.血象

贫血，呈正色素性或低色素性贫血，Ret常增高，可见有核红及红细胞碎片。WBC和PLT多减少，半数患者呈全血细胞减少。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【实验室检查】2.骨髓象

半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增生程度可明显差异。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【实验室检查】3.特殊溶血试验：（1）溶血存在的依据：尿隐血试验或尿含铁血黄素试验阳性。（2）补体敏感的红细胞存在的依据：蔗糖溶血试验、热溶血试验、酸化血清溶血试验。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【实验室检查】3.特殊溶血试验：（3）流式细胞术检测发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59）低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本试验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【诊断和鉴别诊断】1.诊断标准：①临床表现符合PNH或上述必须考虑为PNH的表现情况；②有肯定的血红蛋白尿发作或血管内溶血的直接、间接证据；③实验室检查证明有补体敏感的红细胞群存在和检测CD55及CD59这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况是确诊试验。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【诊断和鉴别诊断】2.鉴别诊断

排除其他溶血病，全血细胞减少还应与再障鉴别。3.再障-PNH综合症的诊断

凡再障转化为PNH，或PNH转化为再障，或兼有两病特征者，均属再障－PNH综合征。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【诊断和鉴别诊断】3.再障-PNH综合症的诊断再障-PNH综合症再分为四种情况：（1）再障-PNH：指原有肯定的再障（而非未能诊断的PNH早期表现），转为可确定的PNH，再障的表现已不明显。（2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4类），转为明确的再障，PNH的表现已不明显。

三、红细胞膜缺陷检查的应用（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症【诊断和鉴别诊断】3.再障-PNH综合症的诊断（3）PNH伴有再障特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以PNH为主，但伴有一个或一个以上部位骨髓增生低下、巨核细胞减少、网织红细胞不增高等再障表现者。（4）再障伴有PNH特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以再障为主，但伴有PNH的实验诊断结果阳性者。

三、红细胞膜缺陷检查的应用

临床症状与实验室检查PNH再障出血较少，且程度较轻常有，程度较重感染较少较多巩膜黄染部分病例有无肝脾肿大部分病例有偶见全血细胞减少约半数病例有所有病例有血小板波动约半数病例有，可达正常少有波动感染时白细胞升高反应无有少有网织红计数常增高常减少骨髓增生活跃及明显活跃约90.5%约40.7%中性粒细胞碱性磷酸酶积分很低增高血清胆红素明显增高可轻度增高蔗糖溶血试验阳性阴性尿含铁血黄素试验均有罕见酸化血清溶血试验阳性阴性PNH与再障的鉴别第三节红细胞酶缺陷检查及应用一、概述

红细胞酶缺陷是指参与红细胞代谢（主要是糖代谢）的酶由于基因突变导致的酶活性或性质改变所引起的溶血及（或）其他表现的疾病。

一、概述

最常见的为葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸激酶缺陷症。

按细胞内代谢作用不同糖酵解途径的酶缺乏己糖激酶（HK）葡萄糖磷酸异构酶（GPI）丙酮酸激酶（PK）磷酸果糖激酶（PFK）戊糖磷酸旁路代谢的酶缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）核苷酸代谢的酶缺陷嘧啶5’核苷酸酶（P5’N）腺苷酸激酶（AK）一、概述

乳酸脱氢酶葡萄糖6-磷酸葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乳酸5-磷酸核酮糖6-磷酸葡萄糖酸ADPATPNADHNAD-丙酮酸激酶NADPH+H+NADP+NADP+G6PD6PGD谷胱甘肽还原酶NADPH+H+氧化型谷胱甘肽谷胱甘肽还原型谷胱甘肽谷胱甘肽过氧化酶H2OH2O2参与核苷酸代谢或转变为3-磷酸甘油醛后参与糖酵解糖酵解途径戊糖磷酸旁路途径红细胞的糖代谢二、实验室检查（一）高铁血红蛋白还原试验【实验原理】在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP变成NADPH，其脱下的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+），比色测定。当G-6-PD缺乏时，由于NADPH生成减少或缺乏，高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，高铁血红蛋白还原率下降。

二、实验室检查（一）高铁血红蛋白还原试验【实验原理】

G-6-PG-6-PDNADP还原型美蓝高铁血红蛋白（Fe3+）高铁血红蛋白还原酶6-磷酸葡萄糖酸NADPH氧化型美蓝血红蛋白（Fe2+）二、实验室检查（一）高铁血红蛋白还原试验【参考区间】正常人高铁血红蛋白还原率≥75%（脐带血≥77%）。【临床意义】G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31%～74%，严重缺乏（半合子或纯合子）<30%。

二、实验室检查（二）变性珠蛋白小体生成试验【实验原理】G-6-PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37℃孵育2～4小时，使血红蛋白变性，用煌焦油蓝等碱性染料染色观察红细胞珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。【参考区间】正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般<30%。

二、实验室检查（二）变性珠蛋白小体生成试验【临床意义】

变性珠蛋白小体，主要是α、β珠蛋白链的病变而引起的溶解度和稳定性降低所致；是一种变性血红蛋白颗粒，一般附着在细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体，变性珠蛋白小体可被碱性染料着色。该实验与异丙醇试验和热不稳定实验样可作为不稳定血红蛋白存在的一种证据。

二、实验室检查（二）变性珠蛋白小体生成试验【临床意义】G-6-PD缺乏症常高于45%，可作G-6-PD缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%～84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。

二、实验室检查（二）变性珠蛋白小体生成试验【临床意义】G-6-PD活性正常时，RBC通过磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb还原成亚铁血红蛋白，因而含变性珠蛋白小体的RBC减少，而G-6-PD活性减低时，NADPH减少，MHb增多，导致含变性珠蛋白小体的RBC增多，不稳定血红蛋白由于血红蛋白分子结构发生改变，稳定性减低易被氧化，含变性珠蛋白小体的RBC可增多，伯氨喹啉型溶血性贫血，含变性珠蛋白小体的RBC也可增多。

二、实验室检查（三）G-6-PD荧光斑点试验和活性测定【实验原理】在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。

二、实验室检查（三）G-6-PD荧光斑点试验和活性测定【参考区间】正常人有很强荧光。正常人酶活性为：（8.34±1.59）U/gHb（37℃）（ICSH推荐的Glock与McLean法）；（12.1±2.09）U/gHb（37℃）（WHO推荐的Zinkham法）G-6-PD缺陷者的荧光很弱或无荧光；杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光。

二、实验室检查（三）G-6-PD荧光斑点试验和活性测定【临床意义】G-6-PD缺陷见于蚕豆病、伯氨喹啉型药物性溶血性贫血。利用此实验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。

二、实验室检查（四）丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定【实验原理】在ADP存在的条件下催化PEP转化成丙酮酸，在NADH的作用下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，荧光标记NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD，检测以上过程荧光消失的时间反应PK的活性。

PEPADPLDH乳酸丙酮酸PKATP荧光标记NADHNAD+二、实验室检查（四）丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定【参考区间】正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb。【临床意义】荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25～60分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【概述】红细胞G-6-PD基因突变致活性降低和/或酶性质改变，是一种X性连锁隐性或不完全显性遗传性疾病。G-6-PD缺乏时，红细胞膜脂质和膜蛋白巯基的氧化，引起红细胞僵硬，易被脾脏和肝脏中的巨噬细胞破坏导致溶血。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【概述】

分类蚕豆病急性溶血性贫血新生儿高胆红素血症先天性非球形红细胞性溶血性贫血（CNSHA）三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【实验室检查】1.溶血的检查非遗传性有诱因，急性溶血，血管内溶血；而遗传性非球形细胞溶血性贫血具有慢性血管外溶血的实验室特征。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【实验室检查】2.G-6-PD缺乏的筛检试验高铁血红蛋白还原试验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝纸片法。荧光斑点试验的特异性最高，高铁血红蛋白还原试验的敏感性最强3.G-6-PD确诊试验G-6-PD活性定量检测能准确反映酶的活性。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【诊断和鉴别诊断】诊断依据是红细胞G-6-PD活性的实验室检查，临床表现及阳性家族史

三、红细胞酶缺陷检查的应用（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症【诊断和鉴别诊断】如筛选试验中两项中度异常；或一项筛选试验中度异常加上Heinz小体生成试验阳性（有40%红细胞含Heinz小体，每个红细胞有5个以上Heinz小体）并排除其他溶血病因；或一项筛选试验中度异常，伴有明确的家族史；或一项筛检试验严重异常；或定量测定G-6-PD活性较正常平均值降低40%以上，均可确诊。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（二）丙酮酸激酶缺陷症【概述】PK基因缺陷，常染色体隐性遗传，仅次于G-6-PD缺陷症。PK缺陷时，ATP产生减少，引起血管外溶血，表现为慢性溶血性贫血。

三、红细胞酶缺陷检查的应用（二）丙酮酸激酶缺陷症【实验室检查】1.筛检试验红细胞自溶血试验、PK荧光斑点试验。2.酶活性定量试验PK活性检测。3.ATP测定4.中间代谢产物测定①2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）②磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）③2-磷酸甘油酸（2-PG）

三、红细胞酶缺陷检查的应用（二）丙酮酸激酶缺陷症【诊断和鉴别诊断】1.红细胞PK缺乏的实验室诊断标准。2.遗传性红细胞丙酮酸激酶缺乏症主要通过红细胞PK活性的测定进行诊断。

第四节血红蛋白病的检查一、概述（一）血红蛋白的结构成熟红细胞中的主要蛋白质是血红蛋白（Hb），占细胞干重的96%，占细胞容积的35%。正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。血红蛋白的合成受铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。

一、概述（一）血红蛋白的结构

分子结构：由血红素和珠蛋白构成，其分子由四个亚基构成，即两个α亚基和两个β亚基，可组装成α2β2结构血红蛋白合成：65%合成于有核RBC期，35%合成于Ret期血红蛋白是一种结合蛋白，分子量约为64458每个亚基由：一条珠蛋白肽链和一个血红素分子构成血红素是铁原子和原卟啉Ⅸ的复合物。为含铁卟啉衍生物，铁原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉环中心珠蛋白肽链有6种：α、β、γ、δ、ε、ζ。出生后白主要有α、β、γ、δ四种珠蛋白肽链一、概述（一）血红蛋白的结构正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。血红蛋白的合成受铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。血红蛋白由四条非共价结合的球蛋白链组成，每条链结合一血红素基团，亦即血红蛋白分子的氧结合位点。

一、概述（一）血红蛋白的结构

血红蛋白血红素铁原子原卟啉Ⅸ珠蛋白α、β、γ、δ、ε、ζ。出生后主要有α、β、γ、δ四种珠蛋白肽链一、概述（一）血红蛋白的结构血红素是铁原子和原卟啉Ⅸ的复合物，是含铁卟啉衍生物，铁原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉环中心。血红素是血红蛋白的组成成分，是Hb、Mb、多种酶和多种细胞色素的辅基，其合成于有核红细胞和肝细胞的线粒体内。

一、概述（一）血红蛋白的结构血红素合成后，离开线粒体，在胞质内与珠蛋白肽链结合为血红蛋白；血红素由脾脏、骨髓、肝脏中的巨噬细胞吞噬降解。在血红素合成过程中酶的缺陷引起卟啉或其前体在体内蓄积可导致卟啉病。

一、概述（一）血红蛋白的结构珠蛋白按四级结构与血红素形成血红蛋白，血红蛋白的每个亚基由一条珠蛋白肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下成球形，把血红素分子包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。

一、概述（一）血红蛋白的结构

胚胎期：HbGower1（δ2ε2）HbGower2（α2ε2）HbPorthland（ζ2γ2）3周出现，12周完全消失出生后：HbA(α2β2)：占总量的96%～98%HbA2(α2δ2)：占总量的1.2%～3.5%HbF(α2γ2)：出生后迅速下降，2岁时接近成人HbF占总量的2%以下胎儿后2/3期和新生儿期：HbF(α2γ2)：胎儿血红蛋白珠蛋白多肽链合成规律性一、概述（二）影响血红蛋白结构和功能的因素

影响血红蛋白结构和功能的因素珠蛋白基因缺失或缺陷一种或一种以上的珠蛋白肽链不能合成或合成不足HbH(β4)HbBarts(γ4)肽链一级结构中的某一氨基酸被替换或丢失酶缺陷MHb化学药物中毒MHbSHbHbCO一、概述（二）影响血红蛋白结构和功能的因素1.珠蛋白基因缺失或缺陷珠蛋白基因缺失或者基因缺陷导致珠蛋白肽链不能合成或合成不足，如α珠蛋白基因缺失，α链不能合成或合成不足，结果形成的HbH(β4)、HbBarts(γ4)两种异常血红蛋白，对氧有极高的亲和力，失去向组织释放氧的功能，并且极不稳定，容易发生沉淀而形成包涵体，导致溶血

一、概述（二）影响血红蛋白结构和功能的因素1.珠蛋白基因缺失或缺陷基因的缺陷导致肽链的一级结构中的某一氨基酸被替换或丢失，影响血红蛋白结构的稳定性和功能，如对氧亲和力过高导致细胞增多症；结构的异常导致血红素中的Fe2+易被氧化成Fe3+，形成高铁血红蛋白（MHb），失去运输氧的功能，不稳定，易形成变性珠蛋白小体，导致溶血；珠蛋白的异常还可使红细胞形态异常，如靶形红细胞、镰状红细胞等。

二、实验室检查

血红蛋白电泳抗碱血红蛋白检测血红蛋白F酸洗脱试验异丙醇沉淀试验热变性试验红细胞包涵体试验二、实验室检查（一）血红蛋白电泳【实验原理】

根据不同的血红蛋白具不同的电荷，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动，不同的血红蛋白所带电荷和相对分子量不同，可分离出各自的区带。

二、实验室检查（一）血红蛋白电泳【参考区间】①pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳，适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与HbBarts不能分开和显示。②pH6.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳主要用于HbH和HbBarts的检出。

二、实验室检查（一）血红蛋白电泳【临床意义】

通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如HbH、HbE、HbBarts、HbS、HbD和HbC等异常血红蛋白。HbA2增多（α2δ2），见于β珠蛋白生成障碍性贫血，HbE病时也在HbA2区带位置处增加，但含量很大。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。

二、实验室检查（二）抗碱血红蛋白检测【实验原理】胎儿血红蛋白（HbF）具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合，作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性存在于上清中，而HbA变性沉淀，取上清液于540nm处测定吸光度，检测出HbF的浓度。

二、实验室检查（二）抗碱血红蛋白检测【参考区间】成人<2%，新生儿<40%。【临床意义】1.HbF绝对增多珠蛋白生成性贫血时HbF增加，重型者达30%～90%，中间型常为5%～30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100%。2.HbF相对增多某些血液疾病。3.HbF生理性增多多见于孕妇及新生儿。

二、实验室检查（三）血红蛋白F酸洗脱试验【实验原理】HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbA强。将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。

二、实验室检查（三）血红蛋白F酸洗脱试验【参考区间】

正常血片含HbF的着色红细胞<0.02（<2%）；孕妇可有轻度增加。【临床意义】珠蛋白生成障碍性贫血着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数染成红色的细胞。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。

二、实验室检查（四）异丙醇沉淀试验【实验原理】异丙醇是非极性溶剂能降低血红蛋白分子内部氢键，不稳定血红蛋白更快地裂解沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。

二、实验室检查（四）异丙醇沉淀试验【参考区间】

正常人血红蛋白液为阴性（30分钟内不沉淀）。【临床意义】不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现沉淀，20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。

二、实验室检查（五）热变性试验【实验原理】不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。【参考区间】正常人热沉淀的血红蛋白<1%。【临床意义】

血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白的存在。

二、实验室检查（六）红细胞包涵体试验【实验原理】将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。观察温育2h含包涵体的红细胞是否比温浴10min的阳性细胞多，可了解是否有HbH等不稳定血红蛋白的存在。

温育10min10min～2h3h或更长网织红细胞显现出来HbH病红细胞内包涵体形成其它不稳定血红蛋白形成珠蛋白变性沉淀二、实验室检查（六）红细胞包涵体试验【参考区间】正常人<0.01（<1%）。【临床意义】1.不稳定血红蛋白病孵育1～3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。G-6-PD缺乏或细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。2.HbH病孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。

三、血红蛋白病检查的应用血红蛋白病是由遗传性或基因突变所致的珠蛋白肽链结构异常或合成肽链速率的改变，而引起血红蛋白功能异常所致的疾病。

血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血，常见的疾病：异常血红蛋白病，常见的疾病：（珠蛋白链数量异常，常染色体隐性遗传）（珠蛋白链结构异常，常染色体显性遗传）β-地中海贫血α-地中海贫血镰状细胞贫血（HbS病）血红蛋白E病血红蛋白病分类三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血

珠蛋白生成障碍性贫血定义又称为地中海贫血或海洋性贫血，它是由于遗传的基因缺陷导致血红蛋白中至少一种珠蛋白合成缺乏或不足，引起的贫血或病理状态。分类按缺乏的珠蛋白链的种类分类α珠蛋白生成障碍性贫血β珠蛋白生成障碍性贫血按缺乏的珠蛋白链的程度分类完全无生成的α°、β°珠蛋白生成障碍性贫血部分生成的α+、β+珠蛋白生成障碍性贫血β和δ两种珠蛋白链均缺乏（βδ）°或（βδ）+珠蛋白生成障碍性贫血三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【概述】1.β珠蛋白生成障碍性贫血

珠蛋白生成障碍性贫血中发病率最高的一种类型。第11号染色体上控制β珠蛋白链合成的基因突变，β珠蛋白链合成受到抑制，杂合子的α链的合成速度比β链快2.0～2.5倍，纯合子的α链合成的速度超过β链更多，甚至可完全没有β链合成。

三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【概述】1.β珠蛋白生成障碍性贫血

多余的α链将导致：①α链聚合成不稳定的四聚体（α4）增加，HbA2和HbF含量增加；②很不稳定，容易发生沉淀，形成靶形红细胞；③α链包含体附着于红细胞膜，使红细胞僵硬，导致无效造血；④红细胞对钾离子的通透性增加，能量代谢能力降低，生存期缩短。

三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【概述】1.β珠蛋白生成障碍性贫血

分类轻型杂合子β珠蛋白生成障碍性贫血没有任何症状和贫血，但血涂片中可发现少数靶形红细胞，红细胞脆性试验有轻度减低，HbA2轻度增高（大于3.5%）是其特点。重型纯合子β珠蛋白生成障碍性贫血父母双方均为轻型β珠蛋白生成障碍性贫血，出生后贫血进行性加重，有溶贫临床表现，有地中海贫血面容。相关实验室检查明显异常。中间型β珠蛋白生成障碍性贫血β珠蛋白生成障碍性贫血纯合子型或双重杂合子型。三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【概述】2.α珠蛋白生成障碍性贫血由于α珠蛋白基因的缺乏或缺陷使α珠蛋白链合成速度明显降低或几乎不能合成引起的。由第16对染色体上两对联锁的α珠蛋白基因（父母双方各继承两个）所控制。

三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【概述】2.α珠蛋白生成障碍性贫血

分类静止型一个α基因异常患者无血液学异常表现标准型2个α基因异常红细胞呈低色素小细胞性改变，无症状或轻度贫血HbH病3个α基因异常，为α°/α+双重杂合子，有代偿性溶血性贫血表现胎儿水肿综合症4个α基因异常，完全无α珠蛋白生成，为α°/α°纯合子三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【实验室检查】1.血象贫血轻重不等，红细胞大小不均，靶形RBC、碎片多大于10%，Ret增多，红细胞脆性减低。2.血红蛋白电泳检测出异常血红蛋白。3.骨髓象骨髓中红细胞增生极度活跃，粒红比例倒置，呈无效性增生和原位溶血。4.基因诊断

三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【诊断和鉴别诊断】诊断依据①临床表现；②血液学改变，血红蛋白电泳是诊断本病必备条件；③遗传学检查可确定纯合子、杂合子、及双重杂合子等，最可靠的方法是家族史的研究；④基因诊断可以鉴定基因型，并可作为确诊试验。

三、血红蛋白病检查的应用（一）珠蛋白生成障碍性贫血【诊断和鉴别诊断】

各型珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白电泳结果类型HbA2HbF异常Hbα珠蛋白生成障碍性贫血HbH病正常HbH5%～30%HbBarts病降低正常HbBarts＞90%β珠蛋白生成障碍性贫血轻型3.5%～7%10%～30%重型1%～5%60%～98%βδ混合型100%HbE/β15%～40%HbE60%～80%三、血红蛋白病检查的应用（二）异常血红蛋白病1.镰状细胞贫血（HbS病）【概述】

出现异常血红蛋白S的常染色体显性遗传疾病。因HbA的β链形成HbS（Hbα2β26谷→缬），当血氧过低时HbS互相聚集，形成纤维状多聚体。当有足够的多聚体形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形，此过程称“镰变”。