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文档简介

基因组测序与序列组装基因组测序与序列组装基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合,以确定基因以及其他重要的序列在DNA顺序中的位置主要内容1.DNA测序的方法2DNA序列的组装3.基因组测序的其他路线4.人类基因组的测序和组装4.1DNA测序的方法DNA测序技术主要有两种方法,都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法(thechainterminationmethod),是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法(chemicaldegradationmethod),是将双链DNA分子用化学试剂处理,产生切口,用同位素标记进行测序A.双脱氧链终止法原理DNA复制模板DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTP政(的加在反废爱統双知3(基)核就三止延伸,链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延如此得到3端终止于ddNTP的一系列长度不等的核酸片段4个反应体系中分别加入4种不同的ddNTP,浓度低于dNTP。反应终止后,分四个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶),分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3'端的双脱氧碱基,可依次阅读合成片段的碱基排列顺序A.双脱氧链终止法TAAGCTCGACTdotp,dGTP.dATP.dTTHdETPGATESGAGITddtCUdaGAddA.双脱氧链终止法双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求高酶活性无5’一3·外切核酸酶活性,5’一3’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的链无3’-5’外切核酸酶活性,3-5外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身错误天然的DNA聚合酶不能满足,需要进行改造Klenow聚合酶:来自大肠杆菌DNA聚合酶I,外切酶活性去除,酶活性不够,250bp测序酶Sequenase:噬菌体T7编码A.双脱氧链终止法双脱氧链终止法要求单链作为模板:将DNA克隆到质粒载体中:碱变性或热变性变为单链双向测序;污染,干扰以M13载体克隆单链DNA:无需变性,直接测序3kb,扩增时容易发生丢失与重排,小片段DNA测序以噬菌粒(phagemid)克隆DNA:改造的质粒载体2个复制起始点(质粒自身和M13单链噬菌体在大肠杆菌细胞中产生单链噬菌粒,>10kbdnA测序PcR产生单链DNA中英联合实验室模板DNA工基正常引物携带金属粒引物PCR自血邮□_■可r-hn吸磁法收集扩增引物A.双脱氧链终止法通过M13载体获得单链DNA以测序DM距入H段是利用M13噬菌体在式龄菌体外能以单链形式存在。将待测序DNA片段连接到M13载体中去再利用引物,进行DNA合成,并在合成系统中加入dNTPA.双脱氧链终止法双脱氧链终止法中引物的影响:引物决定了模板链的测序起点,一般来说,是采用克隆位点附近载体上的一段顺序载体DNAA通用引物:与载体DNA中附近插

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