一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释

一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释一个植物乳杆菌隐藏质粒的测序和解释

：潘渠胡袁邓林雷舜胡晓梅胡福泉

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一个植物乳杆菌隐藏质粒的测序和解释

;1.2质粒提取

离心收集植物乳杆菌CICC6002的菌体，用华舜质粒提取试剂盒（华舜，上海）提取质粒。不同于说明书的步骤是：用GTEL溶液（葡萄糖50mmol/L，TrisCl25mmol/L，EDTA10mmol/L，溶菌酶10mg/mL，pH8.0）代替solutionI重新悬浮菌体，并在37℃温育15min，以破坏该菌细胞壁的肽聚糖层。使用华舜胶回收试剂盒分别纯化各质粒条带。

1.3构建测序载体

经预试验确定植物乳杆菌的该质粒具有一个EcoRⅠ酶切位点。对该质粒和载体质粒PUC18使用EcoRⅠ（farmentas,MBI）分别进行酶切，并将酶切产物用T4DNA连接酶连接。连接产物电转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电转化产物涂布于含青霉素、IPTG和XGal的LB平板上，培育18h后挑取白色菌落培育并提取质粒。经酶切鉴定后，送上海生物工程公司测序。

1.4序列解释

利用BLAST序列比对工具对Genbank数据库中全部核酸序列比对，检索该质粒和已知乳杆菌质粒的同源性。利用DNAStar软件标注该质粒可能存在的开放阅读框（ORF）。利用DNAclub软件标注该质粒的重要酶切位点。

2结果

2.1质粒提取

电泳结果显示植物乳杆菌CICC6002的质粒提取液有2条带（图1），分别为5kb和1.3kb.EcoRⅠ酶切试验表明5kb条带不能被EcoRⅠ切开，而1.3kb条带被切开为线状，从1.3kb变为2.1kb（图2）,说明这两个条带是不同的质粒。将1.3kb条带代表的质粒命名为pLP2111.

2.2测序

构建的重组质粒PUC18pLP2111在EcoRⅠ酶切后，电泳显示有2.7kb和2.1kb两条带（图3），证明测序载体构建胜利。测序结果提交Genbank，登录号为：FJ375766.

2.3解释

质粒pLP2111的GC含量为38.3%,BLAST比对结果显示：该质粒与质粒pLP1（GenBanknumber：M31223.1）有99%的相像性。不同之处是质粒pLP2111在1443～1459bp和2051bp处分别多出17bp和1bp的碱基序列（图4）。

通过ORF搜寻，发觉该质粒仅有1个编码框，从262到1215共954bp，编码1个318个氨基酸残基的复制蛋白。乳杆菌、葡萄球菌和链球菌等革兰阳性菌的很多质粒中都存在该复制蛋白。该复制蛋白属于第一复制蛋白超家族，功能为起始质粒的滚环复制。该质粒没有编码影响菌株表型的蛋白，应归为隐藏质粒。通过重复序列检索发觉该质粒有13个重复序列，从1335到1571之间，有1个17bp的序列“cattatcatgtagtgcg”正向重复了13次，该重复序列可能和质粒的拷贝数有关。该质粒的复制起点在2068～2081之间,主要的酶切位点如图5所示。

3争论

质粒是一种资源,发觉新的质粒，对于微生物的遗传讨论和构建具有自主学问产权的表达载体都具有重要意义。植物乳杆菌又是公认平安的微生物，可直接口服，是食品级的微生物，是良好的生物工程菌动身菌株,但由于目前所用的载体转化效率均不高，以致于难以在植物乳杆菌中进行基因工程的操作。查找新的质粒，并从中找到转化效率高的质粒，始终是提高乳杆菌转化效率的方法之一。本文发觉的植物乳杆菌质粒pL2111可以作为构建高效率表达载体的候选质粒，对乳杆菌基因工程讨论有重要意义。

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