第七章 体液蛋白质检验

第七章体液蛋白质检验第1页，课件共26页，创作于2023年2月本章内容概要第一节概述第二节血清总蛋白测定第三节血清清蛋白测定第四季血浆纤维蛋白原测定第五节血清粘蛋白测定第六节其他体液蛋白质测定第七节血清蛋白电泳分析第2页，课件共26页，创作于2023年2月本章教学要求掌握

血清总蛋白测定、血清清蛋白测定、醋酸纤维素薄膜电泳测定血清蛋白熟悉

血浆蛋白质的测定方法及评价、血浆纤维蛋白原测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定血清蛋白了解血浆蛋白质的生理功能、血清粘蛋白测定、其他体液蛋白质测定第3页，课件共26页，创作于2023年2月第一节概述机体蛋白质：体液蛋白质的检测：

机体主要的生物大分子含量：人体固体成分的45%种类：10万，3000~5000种/单细胞功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等疾病发生体液蛋白质异常第4页，课件共26页，创作于2023年2月要判断异常首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点一、血浆蛋白质的组成、功能及分类组成：种类：1000种500种200种含量：μgmgg来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂第5页，课件共26页，创作于2023年2月功能：（1）营养作用，修补组织蛋白，供能；（2）维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%~80%的血浆渗透压，作用是促使组织液回流入血，维持血管内外的水平衡；（3）运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；（4）作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质，血浆PH7.35-7.45；（5）体液免疫防御系统：作为免疫球蛋白与补体等免疫分子；（6）参与凝血与纤维蛋白溶解；除Ⅳ因子外均可（7）催化作用：酶的本质；（8）其他生理功能：代谢调控作用，作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶第6页，课件共26页，创作于2023年2月分类：依据来源、分离方法和生理功能来源肝生成：绝大多数血浆蛋白质其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素第7页，课件共26页，创作于2023年2月分离方法盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）电泳法：醋酸纤维素薄膜电泳：6种琼脂糖凝胶电泳：13种聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种分辨率增高---+纤维蛋白原醋酸纤维素薄膜第8页，课件共26页，创作于2023年2月二、血浆蛋白质的测定方法及评价测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质1、元素组成测定：含N稳定；2、重复的肽链结构：具有多个肽键；3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV吸收；4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接；5、沉淀后借浊度测定：光度计测定；6、光折射测定：折射仪测定。第9页，课件共26页，创作于2023年2月方法化学法

凯氏定氮法－参考方法，双缩脲法(推荐)，酚试剂法，比浊法物理法

电泳法、紫外分光光度法染料结合法免疫化学法第10页，课件共26页，创作于2023年2月根据蛋白质平均含氮量16%计算蛋白浓度凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mgN0.3gpro)消化

用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）

蒸馏

用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；

吸收

用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+]

）滴定

用已标定的无机酸滴（使[H+]恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量原理：第11页，课件共26页，创作于2023年2月评价：优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。

应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法（参考方法）第12页，课件共26页，创作于2023年2月双缩脲法原理：

蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。

双缩脲生成

加热＋NH322H－180022222N端C端第13页，课件共26页，创作于2023年2月评价：优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%＜2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。

应用：常规推荐方法。手工或上机使用。第14页，课件共26页，创作于2023年2月酚试剂法原理：

蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。第15页，课件共26页，创作于2023年2月评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。

第16页，课件共26页，创作于2023年2月比浊法原理：

评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）

某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。第17页，课件共26页，创作于2023年2月电泳法醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂凝胶电泳可将血清蛋白质分为清蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白无部分。评价特异性好，了解蛋白质全貌的有价值方法电泳技术操作繁琐、费时、不易自动化第18页，课件共26页，创作于2023年2月紫外分光光度法

蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260

原理：第19页，课件共26页，创作于2023年2月评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。第20页，课件共26页，创作于2023年2月染料结合法

在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。原理：常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。

第21页，课件共26页，创作于2023年2月免疫化学法原理：血浆蛋白质具有抗原性，利用抗原和抗体的高度特异性反应，形成抗原-抗体复合物，再经过显色的深浅测定浓度有免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫电泳法优点：定量测定个别蛋白质，特异性好、灵敏度高缺点：成本高第22页，课件共26页，创作于2023年2月第二节血清总蛋白测定原理第23页，课件共26页，创作于2023年2月

这种紫红色络合物在540nm处的吸光度值与蛋白质的含量在10~120g/L范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋白质标准液比较，即可求出蛋白含量。540nm↑条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。第24页，课件共26页，创作于2023年2月参考范围：成人60－80g/L临床意义：总蛋白升高：总蛋白降低：①丢失过多②吸收不足、消耗增加③白蛋白合成减少