生化技术亲和层析

生化技术亲和层析第1页，课件共39页，创作于2023年2月物质分离纯化的依据

利用各分离物质理化特性的差异性但由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解决这一问题，一种有效的分离方法应运而生——亲和层析第2页，课件共39页，创作于2023年2月亲和层析的概念

利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法第3页，课件共39页，创作于2023年2月第一节基本原理第4页，课件共39页，创作于2023年2月一、基本原理1.亲和层析载体的组成配体L以共价键结合到活化的基质M上，构成固相载体2.原理首先待分离物质S借助静电引力、范得华力及结构互补效应等作用吸附于固相载体上，与其它物质分离；然后通过改变起始缓冲液的pH值，或增加离子强度，或加竞争性抑制剂等方法使待分离物从固相载体上脱离下来第5页，课件共39页，创作于2023年2月二、分类特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者第6页，课件共39页，创作于2023年2月三、特点优点：上样量大，分辨率高，操作步骤少，被分离物质的活性不易丧失缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备成固相载体第7页，课件共39页，创作于2023年2月第二节操作第8页，课件共39页，创作于2023年2月一、基质的选择一种理想的亲和层析基质应满足的条件特异性强（非特异性吸附少）高度的亲水性性质稳定具有大量容易被活化的基团，且容易与配体结合适当的孔径和筛孔数目第9页，课件共39页，创作于2023年2月常用亲和吸附剂采用的基质

一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力

目前使用最广泛的是Sepharose4B，它是有D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大第10页，课件共39页，创作于2023年2月二、配体的选择

通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、polyA、polyU、染料和金属等）等第11页，课件共39页，创作于2023年2月1.与被纯化物质有适宜的亲和力

一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是不利的如：用抗生物素蛋白（亦称亲和素）作为配体纯化含生物素的羧化酶时，由于抗生物素蛋白-生物素解离常数接近1×10-15mol，要其分离，必须在6mol/L盐酸胍溶液，pH1.5的剧烈条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下，羧化酶的活性大部分已发生不可逆性丧失第12页，课件共39页，创作于2023年2月2.具有与基质共价结合的基团

该基团和基质结合后，对配体与待纯化物质的亲合力没有影响或影响不明显第13页，课件共39页，创作于2023年2月三、亲和吸附剂的制备偶联方法物理方法包埋法和吸附法等化学方法偶联法：利用CNBr、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物交联法：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质与配体

CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤第14页，课件共39页，创作于2023年2月1.活化将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，然后加入等量的D.W和2mol/L溶液（pH11~12），混匀称取适量固体CNBr（50~300mg/g贮存胶），溶于二甲基甲酰胺溶液中活化：将溶好的CNBr溶液加入琼脂糖悬浮液中活化洗涤：将冷却的反应液转入布氏漏斗中，用10~20倍体积的预冷水及0.07mol/L溶液（pH8.5）洗涤第15页，课件共39页，创作于2023年2月边加边搅拌反应液应始终保持pH11~12反应会放热，要用水浴中加碎冰的方法控制温度在20℃维持8~10min后，再加入大量碎冰使反映体系快速冷却至4℃或更低温度整个活化过程越快越好：因为活化的Sepharose在碱性条件下不稳定注意第16页，课件共39页，创作于2023年2月2.偶联

向已经活化和洗涤的基质中加入等体积的0.2~0.25mol/L缓冲液（含0.5mol/L

NaCl和1~10μmol/ml）混合，缓慢搅拌（室温2h;4℃过夜）至配体与基质充分偶联注意：对于偶联极牢固（如多结合位点）会失活的大分子物质配体，则应在低pH（6.0~6.5）缓冲液中反应；或将活化的基质事先置pH8.3的碱性溶液中部分水解，适当降低其偶联活性；从而提高配体的活性第17页，课件共39页，创作于2023年2月3.洗涤

在基质和配体偶联后的溶液中加入用HCl调pH9.0的乙醇胺溶液，在搅拌下反应15min，或在弱碱溶液中放置过夜，或在Tris-HCl溶液，pH8.0，放置2h；然后室温条件下分别用NaHCO3溶液、Na2B4O7溶液、NaCl溶液洗涤吸附剂，除去过剩的配体和乙醇胺第18页，课件共39页，创作于2023年2月4.配体结合量的测定

配体结合量是表示吸附剂中束缚的配体浓度的指标，通常作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。一般用每毫升或每克贮存胶束缚的配体量来表示，如mg/ml

其测定方法有直接测定法和间接测定法第19页，课件共39页，创作于2023年2月（1）直接测定法①2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验

在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中加入1ml饱和的硼酸钠溶液，3滴3%的2,4,6-三硝基苯磺酸盐水溶液，室温反应2h。不同的亲和吸附剂具有不同的颜色：未被配体取代的基质呈黄色配体为脂肪族氨基衍生物的呈橙色配体为芳香族氨基衍生物的呈橙红色未取代的肼衍生物呈深红色然后根据各种显色物质的吸光度值计算配体的含量（比色法）第20页，课件共39页，创作于2023年2月②根据配体的特性进行测定

首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下，用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计算出配体的含量）第21页，课件共39页，创作于2023年2月（2）间接测定法①推算法

将偶联过程中加入配体的量减去偶联后洗脱出来的配体量，除以沉积胶的量，即可推算出配体的结合量（如mg/g沉积胶）②根据亲和吸附剂对被吸附物的操作容量计算配体的结合量

将亲和吸附剂装入柱中，加入待分离大分子物质，使其结合量达到最大，先用适当的洗涤剂洗去杂质，然后用特异性洗脱剂洗出待分离的大分子物质，根据分离出的大分子物质的量，计算配体的结合量将少量纯品大分子物质陆续加入到亲和层析柱中，直至饱和平衡，然后根据上样量推算出配体的结合量第22页，课件共39页，创作于2023年2月四、特异性吸附

当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不同，所以可得到分离和纯化

样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关外，还与样品的pH值、离子强度和反应时间有关例1图7-6，Sepharose-氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现

①在高pH条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大

②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小例2用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离γ-球蛋白时，上样后反应1h比3h得率高第23页，课件共39页，创作于2023年2月五、分离大分子物质

上样后，可用大量平衡液（即起始缓冲液）洗去无亲和力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤，使柱子上只剩下专一吸附的大分子物质；最后用相应的洗脱剂洗脱有效成分，其具体操作方法可根据配体与有效成分的亲合力决定①亲合力较小时，可用大体积的平衡液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰②亲合力一般时，主要靠改变缓冲液的性质（如改变pH或离子强度或者同时改变pH和离子强度），降低复合物之间的亲合力而解离洗脱注意：用酸性或碱性pH值洗脱是，可得到十分集中的蛋白峰，但洗脱收集的蛋白质液应立即中和、稀释或透析，以免造成有效成分活性丧失③亲合力较强时，可用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱第24页，课件共39页，创作于2023年2月竞争性洗脱剂专一性强，并能洗脱出和配体特异性结合的大分子物质；但洗脱需要的洗脱液较多剧烈的洗脱条件如用盐酸胍、尿素等变性剂配制的溶液洗脱蛋白质等生命大分子物质时洗脱液须及时处理恢复有效成分的活性；如透析法等第25页，课件共39页，创作于2023年2月六、亲和层析柱的再生

用过的亲和层析柱应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，并用平衡缓冲液重新平衡层析柱第26页，课件共39页，创作于2023年2月第三节提高吸附剂的操作容量第27页，课件共39页，创作于2023年2月影响吸附剂操作容量的因素①配体的性质②配体在吸附剂中的含量③配体与吸附物结合时的位阻效应大小④基质的多孔性⑤操作条件第28页，课件共39页，创作于2023年2月一、在配体和基质间引入“手臂”1.原理在配体和基质间引入“手臂”，使配体离开基质的骨架，减小基质的立体（空间）位阻效应，增加配体的活动度和伸入溶液的深度，提高吸附剂的操作容量（特别使用于小分子配体）例用对氨基苯硫代吡喃作为配体，Sepharose4B为基质纯化β-半乳糖苷酶时，如果将配体直接连接在基质上，则不能吸附β-半乳糖苷酶，而当在基质和配体之间引入3,3’-二氨基二丙胺琥珀酰胺手臂时，则可有效吸附β-半乳糖苷酶注意：并非手臂越长越好，因为太长可能折叠弯曲，反而降低吸附容量第29页，课件共39页，创作于2023年2月2.吸附剂衍生物的制备①琼脂糖活化②将氨基化合物（如1,6-己二胺;6-氨基己酸等）共价结合于活化的琼脂糖上制成稳定的琼脂糖衍生物③在碳二亚胺存在下，基质通过手臂与含羧基或氨基的任何化合物结合成固相载体④将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有不同长度“手臂”的亲和吸附剂第30页，课件共39页，创作于2023年2月二、增加配体取代的程度对于解离常数较大的配体而言，增加配体在基质中的浓度也是增加吸附剂结合量的有效方法

①在配体量一定时，可通过提高基质活化时的pH值和增加CNBr的用量，增加基质活性基团的数量，从而增加基质对配体的偶联量②当基质活化度一定时，可通过提高偶联反应液的pH值或增加配体浓度来增加配体的偶联量第31页，课件共39页，创作于2023年2月三、配体与基质以最小的键连接配体以较少的共价键连接到载体时，有利于保持蛋白质、多肽类配体自身的高级结构状态，保持其生物活性。蛋白质一般以非质子化形式的游离-NH2与活化的基质反应，当偶连反应在pH＞9.5条件下进行时，配体的大量游离氨基都会与基质连接，而在相对不利的pH条件下（如pH＜7.0）进行时，就能减少配体与基质连接的键

例：在pH6.0～6.5条件下偶联的抗体衍生物较pH9.5偶联的衍生物对抗原的吸附量高得多第32页，课件共39页，创作于2023年2月四、基质多孔性的影响

亲和层析的基质多用生物胶（聚丙烯酰胺凝胶）和琼脂糖凝胶，但生物胶在偶联配体后会导致多孔性降低，致使结合物（被分离组分）不能渗透到凝胶筛孔中与配体结合；而琼脂糖多孔性的稳定性较生物胶好，故多选择琼脂糖作为基质提高吸附剂的吸附容量第33页，课件共39页，创作于2023年2月五、其他样品浓度、pH值、离子强度、上样速度等因素也会对提高操作容量产生影响第34页，课件共39页，创作于2023年2月第四节应用实例第35页，课件共39页，创作于2023年