实验九-氨基移换反应及其产物的鉴定-20081215课件

实验十四氨基移换反应及其产物的鉴定一、实验目的和要求1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2、学习纸层析的原理和操作技术。二、实验基本原理1.氨基移换反应：

在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。

GPT催化下的转氨基反应为：

L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT)的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。2.纸层析原理：

滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。

用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。3.茚三酮的显色原理：氨基酸+茚三酮类紫红色复合物三、实验材料与试剂1、实验材料动物肝脏(牛蛙肝或猪肝）2、实验试剂⑴0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨反应所需缓冲溶液）⑵0.1mol/Lα－丙氨酸（pH7.4）（转氨反应底物，同时作为纸层析点样时的标准样品）⑶0.1mol/Lα－酮戊二酸（pH7.4）（转氨反应底物）⑷0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析点样时的标准样品）⑸展层溶剂－酚溶液（纸层析用）⑹10％三氯乙酸（终止酶促反应，同时使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀下来）⑺0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）⑻显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）四、实验器材与仪器⑴匀浆器或研钵⑵试管及试管架⑶恒温水浴箱（37℃、100℃）⑷铅笔、尺和圆规⑸毛细管（直径0.5mm)⑹新华定性滤纸（直径11cm）⑺剪刀和镊子⑻电吹风⑼滴管⑽康氏皿⑾喷雾器⑿烘箱（80℃）五、实验操作方法和步骤1、酶液的制备取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎放入匀浆器中加12ml磷酸缓冲液，将肝脏匀浆液或用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、氨基移换反应

取4支洁净、干燥的试管，按表1操作管号试剂、操作1234转氨酶提取液（ml）11110.25%碘乙酸（ml）0.50.50.50.5预温滴加10％三氯乙酸溶液2滴，100℃×5min置37℃恒温水浴保温5min0.1mol/Lα－丙氨酸pH7.4（ml）1110.1mol/Lα－酮戊二酸pH7.4（ml）1110.01mol/L磷酸缓冲液pH7.4（ml）1221酶促反应混匀，置37℃恒温水浴保温40min（经常摇动）终止酶反应滴加10％三氯乙酸溶液2滴，置100℃恒温水浴保温5min表13、层析⑴准备：取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)。另取2cm×2cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。⑵点样：用毛细管依次点标准α－丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。1234561——1号管反应样液（α－丙氨酸）2——2号管反应样液（α－丙氨酸）3——3号管反应样液4——4号管反应样液（α－丙氨酸、谷氨酸）5——标准样液：α－丙氨酸6——标准样液：谷氨酸图1——层析滤纸示意图5.5cm1cm⑶展层、显色将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中,平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图2）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80℃）中显色3min。432图2－层析装置示意图1.康氏皿2.展层溶剂3.“灯芯”4.层析滤纸1谷氨酸丙氨酸丙氨酸氨基酸样品的分离图谱溶剂前沿原点651234氨基酸样品的分离图谱六、结果分析讨论七、思考题1.为什么要设计4支反应管？每管所要说明的问题是什么？2.观察实验现象，并对层析后氨基酸的显色情况进行分析。八、注意事项1、避免污染滤纸，不要用手接触。2、点样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。3、实验报告附上层析滤纸。值日2008.12.17.甲－3班下次实验课“自主微型研究课题设计与实践”答辩具体要求：1.每组做一个PPt，选派一个同学作主答，其余同学作应答；2.每个同学在答辩组的答辩过程中至少要提1个感兴趣的或有疑惑的问题；3.各组的PPt电子版和每个同学的电子版报告请在12.22.前发到班里的邮箱，并在12.24.答辩后交打印稿；生化实验总结报告1.简要系统归纳本学期生化实验课所学内容（包括主要实验技术方法），有何